植物原生质体制备及转化试剂盒说明书

植物原生质体是指脱去全部细胞壁由质膜包被的具有生命活力的裸露细胞。它具有细胞生命特征和全能型，是细胞无性系变异和突变体筛选的重要来源，同时也是植物遗传工程的理想受体和遗传改良的理想材料。酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶、离析酶和果胶酶能降解细胞壁成分，去除细胞壁，即可得到原生质体。许多方法可诱导原生质体融合，现在被广泛采用的融合方法是聚乙二醇（PEG）法。聚乙二醇（PEG）作为一种高分子化合物，合适的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高钙高pH法进行清洗，使原生质体融合得以完成。
本试剂盒含有除酶以外植物原生质体制备和转化需要的全部试剂，按照一次使用10ml酶液计算，可以使用20次。
● 贮存和效期：
   按照温度贮存，有效期一年。
● 使用说明：
   需要准备的材料（试剂盒不提供）：
   纤维素酶R-10；离析酶R-10；平头镊子；70μm细胞过滤筛；一次性刀片；50ml离心管；1.5ml离心管；水浴锅
一、原生质体分离：
即用型酶溶液配制

	10ml 配制量	20 ml配制量
溶液I（2×）	5 ml	10 ml
纤维素酶R-10	0.15 克	0.3 克
离析酶R-10	0.04 克	0.08 克
还原剂	5 μl	10 μl
50mg/ml BSA	0.2 ml	0.4 ml
灭菌水	定容至10 ml	定容至20 ml

注：即用型酶溶液现用现配。
 
 
 
1. 取生长状态良好的叶片切成0.5-1mm的小条，按照20个叶片加10 ml即用型酶溶液的比例迅速将切割好的叶片小条浸泡于酶溶液中，避光，常温酶解3小时。
注：酶解时间与叶片种类，叶片生长状态有关，请根据实验需要适当延长酶解时间。酶溶液变为绿色表明有原生质体已经分离，显微镜镜检后确定是否分离。
  2. 酶解后加入10 ml溶液II，轻柔混匀。
3. 用孔径70 μm筛网过滤步骤2中的溶液，去除未消化的叶片，收集滤出液于50ml离心管中。
4. 滤出液100g常温离心 2分钟，去除上清。
5. 加1 ml 溶液II重悬原生质体，冰浴30分钟（原生质体会自然沉淀于底部）。
6. 小心去除上清溶液，不要触动原生质体沉淀，沉淀重悬于1 ml溶液III中即为原生质体溶液。
二、原生质体转化：
1. 取10μl质粒DNA(浓度为1 -2μg/μl)于1.5ml 离心管中。
  2. 加入100μl原生质体溶液，轻柔混匀。
3. 加入等体积即110μl 溶液IV-转化溶液，轻柔彻底混匀，常温放置15分钟，间歇轻柔混匀。
4. 加入2倍体积即440μl 溶液II，轻柔彻底混匀，终止转化过程。
5. 常温100g离心2分钟，去上清。
6. 沉淀重悬于1 ml溶液V中。
三、原生质体培养和收集：
1. 原生质体溶液 常温（20-25℃）孵育2-16小时。
  注：根据实验需求确定孵育时间。RNA分析孵育2-6小时；酶活性分析和蛋白标记实验孵育2-16小时。
  2. 常温100g离心2分钟收集原生质体，去除大部分上清。
3. 原生质体沉淀重悬于剩余溶液中，-80℃贮存。