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从样本制备和转印过程提高western blot的准确性

浏览次数:4911 发布日期:2018-12-11  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负
适当样本准备

样品准备不当,会让你头疼不已,当准备裂解液时:
  • 快速工作
  • 保持低温环境
  • 增加蛋白酶
  • 进行分装,避免反复冻融
如果要分装样品,请确保等量分装,以便检查是否在此过程中丢失了目标。 如果您分离的样品浓度非常低,请记住,使用高灵敏度底物和较少的裂解液。
如果你的裂解液中含有大量的DNA,它就会变得粘稠。 大量的DNA会使样品难以移液,并且可能会在凝胶上产生条纹或污迹。 如果是这种情况,请确保在添加上样缓冲液之前将DNA酶添加到裂解液中。
对于变性凝胶,不要忘记在电泳前将样品在98°C加热5分钟。 这样可以使样品完全变性并确保得到干净锐利的条带。
 
一些技巧可供参考:
使用过滤后的缓冲液,在电泳前仔细检查缓冲液,以确保缓冲液不会随着时间的推移而沉淀。
当取下凝胶梳子时,请非常缓慢地进行,以免孔塌陷或扭曲。
使用上样器进行上样。 在上样时,确保将尖端尽可能靠近孔的底部,缓慢的加入样品,同时小心地将上样器取出。
在每个孔中加载相同的体积,不要空位。
低电压慢跑,特别是最初浓缩样品时。
·    电泳完成后,使用干净的刀片切除凝胶的孔和底部凝胶。 这些会导致轻微的高度差异,可能会干扰转印。

转印

转印是将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移到膜上的过程。
  • 确保“三明治”的所有材料尺寸相同。 滤纸,膜和凝胶都应该是完美的选择。 这样可以防止讨厌的气泡出现在你的膜上。
  • 从胶板中取出凝胶时,不要拉伸凝胶。 用刀片从凝胶上取下底部和孔后,在凝胶上放置几片预先湿润的滤纸,轻轻地将其弄平。 滤纸将作为支撑,小心地剥离凝胶。
·    确保圆形工具驱赶气泡。 动作要轻柔,以免扭曲凝胶。

有很多事情可以在这里出错。
选择适当的标准化策略。 让我们面对现实,无论你多么小心,都可能会得到一个有缺陷的凝胶或膜,这将毁了你的一天实验。 但是,如果您使用总蛋白质染色或加载对照抗体来标准化您的数据,您可以挽救您的实验。例如使用AzureRed总蛋白染色剂,兼容下游western blot实验,配合sapphire 双模式多光谱成像系统,可进行多重荧光检测,定量更准确,使用更方便。
确保目标和内参具有相同的线性范围。 化学发光是半定量成像,避免饱和尤其重要。
选择经过充分验证并在文献中引用的高质量一抗。
使用合适的底物以避免信号饱和。 Azure为您提供Radiance和Radiance plus化学发光底物,以满足您的所有灵敏度需求。
考虑合适的背景去除方法,准确定量条带。
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来源:艾普拜生物科技(苏州)有限公司
联系电话:0512--86860010
E-mail:info@aperbio.com

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