如何减少western blot非特异性条带的产生

非特异性条带？
没有什么比以多个条带结束你的western blot实验更令人沮丧。 这是我的样品吗？ 封闭液的问题？ 抗体的问题？ 如果您正在使用新的样本或抗体，答案可能是，也不确定。 通过一次更改一个变量，对Western进行故障排除是一个痛苦的过程。 我们不能完全地让你所有的问题都消失，但这里有一些提示可以帮助你提高你的印迹质量。
样品的问题？
样品质量差是多个条带的主要来源。 以下是蛋白样本可能出现的一些常见问题。

• 如果您观察到多个条带在预期分子量下，您的蛋白质很可能已经降解。 确保在蛋白质提取过程中添加蛋白酶抑制剂并保持样品低温状态。
• 如果条带大于预期分子量，请检查文献中的磷酸化，糖基化，乙酰化或甲基化等修饰，将蛋白放在更大尺寸的胶中进行跑胶。
• 如果到处都有条带，您可能加载了过多的样品，这些样品会导致对无关的裂解蛋白非特异性吸附。 在样品制备方面，不要忘记在上样前加热到至少60°C使样品变性。
• 您的目的蛋白可能与其他蛋白共享表位。 要进行检查，请运行BLAST搜索以查看目的蛋白的唯一性。
• 另一种可能性是，细胞系中的蛋白质表达随着时间的推移而逐渐消失。 如果可以的话，重新开始使用新的非传代细胞。

封闭液的问题？
使用错误的封闭缓冲液会给你的印迹带来灾难。 许多常用的封闭缓冲液可以掩盖目标上的表位，使其难以检测。 或者是封闭无效产生非特异性结合。


一抗和二抗的问题？
一抗和二抗也会产生麻烦。 在选择一抗时，通常有很多选择。 为获得最佳结果，请选择经过亲和纯化并根据您的应用进行验证的抗体。 亲和纯化从制剂中消除了大量非特异性免疫球蛋白，产生更干净的印迹。 验证您所选择的抗体是否已被您的同伴成功使用可查询抗体搜索引擎，例如CiteAb：https：//www.citeab.com/