知识分享：细胞自噬研究详解

一、自噬简介

     

       1、大自噬（macroautophagy），也就是通常说的自噬（autophagy），是真核细胞蛋白降解的途径之一。自噬可以被描述为细胞质内的成分（细胞器、蛋白等）被双层膜的囊泡包裹，形成自噬体（autophagosome），进而传递到溶酶体进行降解的过程。

      详细来说，自噬过程与内涵体途径（endolysosomal pathway）密不可分（见图1）。一方面，自噬体能够与晚期内体（late endosome）融合形成中间囊泡（amphisome）最终形成自噬溶酶体（autolysosome）；另一方面，自噬体能够直接与溶酶体（lysosome）融合形成自噬溶酶体。无论通过哪条途径，自噬溶酶体最终通过酸性水解酶将细胞器、蛋白等消化分解。

      细胞本底水平的自噬发生在营养充足的条件下，可保护细胞免受错误折叠蛋白或受损细胞器的影响，从而防止某些疾病的发生（如神经退行性疾病和癌症）。饥饿等也可诱导自噬的发生，通过降解大分子物质和细胞器为细胞活动提供营养和能量。

 

图1 自噬过程及其与内涵体途径的关系

(Tom Egil Hansen and Terje Johansen，BMC Biology，2011)

 

2、自噬的调控

 

      雷帕霉素靶蛋白（mTOR）激酶在自噬反应中起着重要的调节作用。mTOR（Akt and MAPK signaling）在被mTOR激酶激活后，自噬反应被抑制；而在mTOR（AMPK and p53 signaling）未被抑制后，自噬反应机制被启动。作为酵母中Atg1的同系物，三个相关的丝氨酸/苏氨酸激酶 UNC-51样酶-1，-2，-3（ULK1, ULK2, UKL3），通过与mTOR复合物之间的相互作用来实现自噬反应。ULK1、ULK2、mAtg13和骨架蛋白FIP200（酵母Atg17的同系物）一起形成一个复杂的复合物。Class III PI3K复合物由hVps34, Beclin-1 (酵母 Atg6的同系物), p150 (酵母Vps15同系物), 和类Atg14蛋白 (Atg14L or Barkor) 或者紫外线放射抗性相关蛋白UVRAG (ultraviolet irradiation resistance-associated gene )蛋白组成，其在诱导自噬反应中起关键作用。Atg基因通过形成Atg12-Atg5 and LC3-II (Atg8-II)复合物来调控自噬体的形成。在Atg7和Atg710（分别对应泛素活化酶E1和泛素结合酶E2酶）的作用下，Atg12和Atg5之间通过一个类泛素反应结合形成Atg12-Atg5，Atg12-Atg5再通过非共价键与Atg16结合形成多聚体Atg12-Atg5-Atg16，参与自噬体的扩张。在Atg4、 Atg7和Atg3的作用下，LC3转变为LC3-II-PE并紧密结合于自噬泡膜表面，参与前自噬体的延伸。

 

      自噬既能抑制也能促进细胞凋亡，两种反应在生物体内广泛存在。在营养缺乏时，自噬反应作为一个细胞的促活反应机制存在，但是过量的自噬反应也会导致细胞死亡，但由自噬导致的细胞死亡与细胞凋亡在形态学上有明显的不同。几种促凋亡信号因子，如TNF, TRAIL, and FADD也会诱导自噬的反应发生。此外，Bcl-2也是自噬反应重要的调节因子，其为凋亡抑制蛋白，通过与Beclin-1结合形成复合物，来抑制由Beclin-1诱导的细胞自噬。

 

      线粒体自噬属于选择性自噬，其主要作用是降解细胞中损伤以及不需要的线粒体。当线粒体损伤之后，在正常的线粒体中持续被降解的PINK蛋白（PARL促进此反应）会处于稳定状态，再通过E3连接酶Parkin的作用来诱导线粒体自噬。Parkin会诱导线粒体膜蛋白的聚泛素化，由此导致与LC3结合的自噬受体蛋白的SQSTM1/p62, NBR1, and Ambra1聚集。此外，在特定的细胞类型中，同样存在LC3结合区域（LIR）的BNIP3 和 BNIP3L/NIX直接通过泛素依赖型反应机制也会聚集自噬反应的相关因子，进而促进自噬体的形成。

 

3、LC3 

      LC3（light chain 3）简称于MAP1LC3 (microtubule-associated proteins light chain 3)，是目前公认的自噬标记物。哺乳动物中的LC3与酵母中的自噬相关蛋白Apg8/Aut7/Atg8具有同源性。

     LC3蛋白合成后在其羧基端被Atg4剪切，暴露甘氨酸残基，产生细胞浆定位的LC3-I。在自噬过程中，LC3-I会被包括Atg7和Atg3在内的泛素样体系修饰和加工，与磷脂酰乙醇胺（PE）共价结合，形成LC3-II并定位于自噬体膜上（见图3）。哺乳动物中的LC3可分为三种： LC3A、LC3B和LC3C。 其中，LC3B作为LC3的一种，同样可以用作自噬的分子标志。

 

图3  LC3在自噬体形成中的作用

(Varuna C. Banduseela et al，Phyciological Genomics，2012)

 

4、自噬流检测方法

 

      细胞经自噬诱导或抑制后，需对自噬流的水平进行观察和检测，常用的技术手段见表1：

 

表1 自噬体计数及自噬流检测方法汇总

（Mizushima et al, Cell, 2010）

      其中，电镜观察法由于受到实验条件和设备的限制应用范围有限；而由于自噬过程发生快速，通过IB/WB检测LC3-II水平和GFP-LC3的方法易受到实验进行时长的影响。

      想要准确检测自噬流的变化，需要多种技术手段共同使用，才能达到理想的实验效果，产生具有说服性的实验结果。

 

自噬双标产品 ：mCherry-GFP-LC3B腺病毒（Adenovirus）、慢病毒（Lentivirus）和腺相关病毒（AAV）

  

 mCherry-GFP-LC3B自噬双标系统的工作原理为： 未发生自噬的细胞及含有自噬体的细胞中，由于mCherry与GFP共同表达，细胞呈现黄色荧光。当自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体后，酸性的溶酶体环境使酸敏感的GFP荧光淬灭，而mCherry不受影响，进而使自噬溶酶体呈现红色荧光。因此，红色荧光可指示自噬溶酶体形成的顺利程度。红色荧光越多，绿色荧光越少，则从自噬体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。反之，自噬体和溶酶体融合被抑制，自噬溶酶体进程受阻（见图4和附图）。

维真现推出mCherry-GFP-LC3B腺病毒、慢病毒和腺相关病毒，满足您实验的不同需要。

·简便直观，实现自噬可视化； 

·准确指示，实现自噬流监测。

 

 

 

自噬相关基因的病毒产品
自噬通路相关基因		表达载体		腺病毒载体		腺病毒
基因名称	基因编号	产品货号	货期	产品货号	货期	产品货号	货期
alfy	NM_014991	CH852478	非现货	AH852478	非现货	VH852478	非现货
ulk1	NM_003565	CH808275	非现货	AH808275	非现货	VH808275	非现货
sqstm1	NM_003900	CH858197	现货	AH858197	现货	VH858197	现货
sqstm1	NM_001142298	CH808956	非现货	AH808956	非现货	VH808956	非现货
p150	NM_005407	CH815035	现货	AH815035	现货	VH815035	非现货
fip200	NM_014781	CH801228	非现货	AH801228	非现货	VH801228	非现货
p150	NM_012414	CH895682	非现货	AH895682	非现货	VH895682	非现货
ampk	NM_017431	CH885062	现货	AH885062	现货	VH885062	现货
ampk	NM_002733	CH842000	现货	AH842000	现货	VH842000	现货
ampk	NM_006253	CH818994	现货	AH818994	现货	VH818994	现货
ampk	NM_006252	CH801722	现货	AH801722	非现货	VH801722	非现货
ampk	NM_206907	CH805185	非现货	AH805185	非现货	VH805185	非现货
pi3k	NM_001142633	CH888389	非现货	AH888389	非现货	VH888389	非现货
p150	NM_014602	CH841329	现货	AH841329	现货	VH841329	现货
pi3k	NM_002649	CH823236	现货	AH823236	现货	VH823236	现货
pi3k	NM_005026	CH864199	非现货	AH864199	非现货	VH864199	非现货
pi3k	NM_006219	CH814123	现货	AH814123	现货	VH814123	现货
pi3k	NM_006218	CH800089	现货	AH800089	现货	VH800089	现货
pi3k	NM_004570	CH892216	现货	AH892216	非现货	VH892216	非现货
pi3k	NM_002646	CH816369	非现货	AH816369	非现货	VH816369	非现货
nbr1	NM_031862	CH824737	现货	AH824737	现货	VH824737	现货
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lamp2	NM_001122606	CH872072	非现货	AH872072	非现货	VH872072	非现货
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lamp1	NM_005561	CH876641	现货	AH876641	现货	VH876641	现货
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rubicon	NM_001145642	CH807619	现货	AH807619	非现货	VH807619	非现货
p150	NM_014633	CH832873	现货	AH832873	现货	VH832873	现货
p150	NM_005483	CH860614	现货	AH860614	现货	VH860614	现货
bcl-2	NM_000633	CH859985	现货	AH859985	现货	VH859985	现货
atg7	NM_006395	CH871029	非现货	AH871029	非现货	VH871029	非现货
atg7	NM_001136031	CH871778	非现货	AH871778	非现货	VH871778	非现货
atg7	NM_001144912	CH879325	非现货	AH879325	非现货	VH879325	非现货
atg5	NM_004849	CH828790	现货	AH828790	现货	VH828790	现货
atg4	NM_032885	CH800065	现货	AH800065	现货	VH800065	现货
atg4	NM_178221	CH804672	现货	AH804672	现货	VH804672	现货
atg4	NM_013325	CH896350	现货	AH896350	现货	VH896350	现货
atg4	NM_178326	CH883248	非现货	AH883248	非现货	VH883248	非现货
atg4	NM_052936	CH878793	现货	AH878793	现货	VH878793	现货
atg4	NM_178270	CH853753	非现货	AH853753	非现货	VH853753	非现货
atg3	NM_022488	CH811236	现货	AH811236	现货	VH811236	现货
atg16l1	NM_017974	CH882182	现货	AH882182	现货	VH882182	现货
atg16l1	NM_198890	CH802102	非现货	AH802102	非现货	VH802102	非现货
atg16l1	NM_001190266	CH807003	非现货	AH807003	非现货	VH807003	非现货
atg16l1	NM_001190267	CH878363	非现货	AH878363	非现货	VH878363	非现货
atg16l1	NM_030803	CH886537	现货	AH886537	非现货	VH886537	非现货
atg14	NM_014924	CH838864	现货	AH838864	现货	VH838864	现货
atg13	NM_014741	CH842100	现货	AH842100	现货	VH842100	现货
atg13	NM_001205122	CH833706	非现货	AH833706	非现货	VH833706	非现货
atg13	NM_001205120	CH871057	非现货	AH871057	非现货	VH871057	非现货
atg13	NM_001205119	CH897141	非现货	AH897141	非现货	VH897141	非现货
atg12	NM_004707	CH821707	现货	AH821707	现货	VH821707	现货
atg10	NM_031482	CH805558	现货	AH805558	现货	VH805558	现货
p150	NM_001150	CH805050	现货	AH805050	现货	VH805050	现货
pras40	NM_032375	CH882903	非现货	AH882903	非现货	VH882903	非现货
p150	NM_007313	CH879027	现货	AH879027	现货	VH879027	现货