蜡样芽孢杆菌核酸检测试剂盒（恒温荧光法）使用说明书

  蜡样芽孢杆菌核酸检测试剂盒（恒温荧光法）

◆ 产品说明

致病菌检测系列基于独特的恒温荧光检测技术，可针对食品、饲料等样品中的致病微生物的特异核酸片段进行扩增，仪器实时监测扩增过程中的荧光信号变化，自动判读结果。本产品用于蜡样芽孢杆菌的检测。检出限为10³ CFU/ml。 

◆ 产品组成（48测试）

011141M
试剂	含量
A-Bac-I	1200μL × 1支
B-I	55μL × 1支
C-I	1200μL × 1支
NG-I	50μL × 2支
PG-Bac-I	50μL × 1支

◆ 适用仪器

   Dhelix 1610、Dhelix 3210、ESE Tube Scanner、Genie II、Deaou-308c等恒温荧光检测仪， ABI 7500，LightCycler480，CFX 96等荧光PCR仪。

◆ 自备耗材和仪器

①灭菌1.5mL或2.0mL离心管；②灭菌0.2mL PCR管或八联管；③冰盒；④移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；⑤离心机；⑥涡旋混匀器；⑦金属浴

◆ 注意事项

1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。

   1）第一区：试剂准备区。

   2）第二区：样本制备区。

 3）第三区：模板添加区。

   4）第四区：扩增及产物分析区。

   ★ 分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。

2．实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。

3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。

4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。

5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。

6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。

7. 检出限为10³ CFU/ml是以1 ml 10³ CFU/ml增菌液离心后收集菌体再提取的细菌基因组DNA作为模板。

◆ 样品处理

参照《SN/T 3932-2014》中的3.4.1处理样品，对样品进行前增菌，制备的菌液保存待用。

冷冻样品应在45 ℃以下不超过15 min或在2 ℃～5 ℃不超过18 h解冻，若不能及时检验，应放于-18℃左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于2 ℃～5 ℃冰箱保存，24 h内检验。

称取样品25 g，放入盛有225 mL LB培养基中进行均质，均质取2~3个适宜稀释度的样品匀液30 ℃±1 ℃培养9 h~18 h。

详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。

◆ 实验操作

将试剂完全解冻，各组分离心30s。

1. 试剂配制（试剂准备区，放置于冰盒中进行）：

若有N个待检样品，则参照下表，按照N+2个数量计算各组分用量（N个待检样品+1个阴性对照+1个阳性对照），将反应液置于0.6ml或者1.5ml离心管中，涡旋混匀，离心30秒，分装于0.2ml PCR管中，并向每管加入1滴C-I（约20μl）。

试剂	使用量
A-Bac-I	22×(N+2)μL
B-I	1×(N+2)μL
反应液总体积	23×(N+2)μL

1. 模板制备（样本制备区）

建议使用试剂配套细菌组DNA提取系列产品，具体过程详见产品说明书。

3．添加模板（模板添加区，放置于冰盒中进行）

       在步骤1中已含有反应液的PCR管中加入2μL模板，顺序为NG-I、待测样品模板、PG-Bac-I。涡旋混匀30s，离心1min，立即进行扩增反应。

4. 扩增反应（扩增及产物分析区）

①恒温仪器63℃条件下反应45min。

      ②若使用荧光定量PCR仪，则荧光基团选择FAM，淬灭基团选择None，将63℃ 15 s，63℃ 45 s作为一个循环，于63℃ 45 s处收集荧光信号，45个循环。 

   其他仪器请参照仪器说明书进行设置。

◆ 结果判定

①仪器自动判定结果，若显示“阳性”，则样品中含有蜡样芽孢杆菌；若显示“阴性”，则样品中不含有蜡样芽孢杆菌或含量低于检测限。

②在荧光定量PCR仪上，根据有无“S”型扩增曲线判定结果。若有“S”型扩增曲线，则样品中含有蜡样芽孢杆菌；若无“S”型扩增曲线，则样品中不含有蜡样芽孢杆菌或含量低于检测限。 

• NG反应管结果显示“阴性”，PG反应管结果显示“阳性”，此次检测结果有效，否则无效。如重复检测结果仍为无效，请与技术支持人员联系。
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