对虾黄头病毒（YHV） 核酸检测试剂盒（一管式恒温荧光法）使用说明书

对虾黄头病毒（YHV） 核酸检测试剂盒（一管式恒温荧光法）

◆ 产品说明

动物疫病检测系列基于独特的恒温荧光检测技术，可针对食品、动物组织等样品中病毒的特异核酸片段进行扩增，通过实时扩增曲线判定结果。本产品用于对对虾黄头病毒（YHV）的检测，检出限为10³copies/μl基因组RNA。

◆ 产品组成（96测试）

◆ 适用仪器

Dhelix-C、ESE Tube Scanner、Genie II、Deaou-308C等恒温荧光检测仪，ABI 7500，LightCycler480，CFX 96等荧光PCR仪。

◆ 自备耗材和仪器

①灭菌1.5mL或2.0mL离心管；②冰盒；③移液器（0.1-2.5μL，0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；④离心机；⑤涡旋混匀器；⑥金属浴

◆ 注意事项

1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。

   1）第一区：样本制备区。

 2）第二区：模板添加区。

   3）第三区：扩增及产物分析区。

★分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。

2．实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。

3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。

4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒。

5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。

6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。

◆ 样品处理

参照《SN/T 1151.4-2011 虾黄头病检疫技术规范》或其他标准处理样品，制备的样本保存待用。

详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。

◆ 实验操作

1. 模板制备（样本制备区）

建议使用配套水生动物病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒系列产品，具体过程详见产品说明书。

2．添加模板（模板添加区，放置于冰盒中进行）

     取出所需测试数的已含有反应液的PCR管，将试剂完全解冻，解冻后打开管盖向各管管底分别加入0.8 μL B-I及0.2μL R-I，盖上管盖离心1 min。打开管盖分别沿各管管壁上加入2μL模板，顺序为NG-I、待测样品模板、PG- YHV -I。盖好PCR管盖后，离心3 min，立即进行PCR扩增反应。

3. 扩增反应（扩增及产物分析区）

①恒温仪器63℃条件下反应45 min。

②若使用荧光定量PCR仪，则荧光基团选择FAM，淬灭基团选择None，将63℃ 15 s，63℃ 45 s作为一个循环，于63℃ 45 s处收集荧光信号，45个循环。 

其他仪器请参照仪器说明书进行设置。

• 结果判定

①仪器自动判定结果，若显示“阳性”，则样品中含有对虾黄头病毒（YHV）；若显示“阴性”，则样品中不含有对对虾黄头病毒（YHV）或含量低于检出限。如在40min~45min间出现曲线上扬而自动判读结果为阴性，可能由于样品含量较低导致，建议对样品进行富集或延长反应时间至60min进行复核。

②在荧光定量PCR仪上，根据有无“S”型扩增曲线判定结果。若有“S”型扩增曲线，则样品中含有对虾黄头病毒（YHV）；若无“S”型扩增曲线，则样品中不含有对虾黄头病毒（YHV）或含量低于检测限。

• NG反应管结果显示“阴性”，PG反应管结果显示“阳性”，此次检测结果有效，否则无效。如重复检测结果仍为无效，请与技术支持人员联系。
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