哈维氏弧菌核酸检测试剂盒（一管式PCR-荧光探针法）使用说明书

哈维氏弧菌核酸检测试剂盒（一管式PCR-荧光探针法）

◆ 产品说明 

动物病害检测系列可针对食品、动物组织等样品中病原的特异核酸片段进行扩增，通过实时扩增曲线判定结果。本产品用于对哈维氏弧菌的检测，检出限为10³copies/μL寄生虫基因组DNA。

• 产品组成（96测试）

• 适用仪器

ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等实时荧光PCR仪。

◆ 自备耗材和仪器

    ①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；③离心机；④涡旋混匀器；⑤金属浴；⑥均质机、搅拌机或研钵等研磨器具；⑦电子天平。

◆ 注意事项

1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。

   1）第一区：样本制备区。

 2）第二区：模板添加区。

   3）第三区：扩增及产物分析区。

   ★ 分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。

2．实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。

3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。

4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。

5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。

6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。

◆ 样品处理

参照下述方法处理样品。

一. 直接检测

1. 病灶组织

(1)若对样本不增菌直接进行检测，则取患病动物的病灶组织做匀浆备用。

2. 水体

(1)取10～100mL养殖水，用筛网过滤，取滤液通过0.22um的硝酸纤维膜过滤；

(2)将滤膜剪碎振荡重悬于500 μL 0.9% NaCl水溶液或无菌生理盐水，12000 rpm 离心5 min，尽量弃净上清液。

二. 增菌检测

取待检样品25g（mL），加入225mL的 TYE液体培养基，用旋转刀片式均质器以8000r/min均质1 min，或者拍击式均质器拍击2 min，制备成1:10的均匀稀释液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵或均质袋中磨碎，再加入10mL TYE液体培养基，于摇床培养24h。

详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。

• 实验操作

1.模板制备（样本制备区）

请参照水生动物病害基因组DNA快速提取试剂盒说明书的提取步骤。

2.添加模板（模板添加区，放置于冰盒上进行）

剪下所需测试数的已含有反应液的PCR管，放置在室温待解冻后，离心30秒后揭开封口膜，向每管反应液中分别加入5μL模板，顺序为NG、待测样品模板、PG-VH-P。盖好配套的PCR管盖后，涡旋混匀30s，离心1min，立即进行PCR扩增反应。

3. 扩增反应（扩增及产物分析区）

使用荧光定量PCR仪，荧光基团选择FAM，淬灭基团选择TAMRA。

按下列条件设置扩增反应：

• 结果判定

检测样品无Ct值或≥40，曲线为直线或轻微斜线，无“S”型扩增曲线，可报告样品阴性，不含有哈维氏弧菌或含量低于检出限；

检测样品Ct≤36，曲线呈“S”型扩增曲线，可直接报告样品阳性，含有哈维氏弧菌；

检测样品36<Ct≤40，需进行一次重复实验，若Ct值仍处于36和40之间且呈“S”型扩增曲线，同时阴性对照无Ct值，报告样品阳性，否则报告样品阴性。

• NG反应为平滑直线，PG反应为“S”型扩增曲线，此次检测结果有效，否则无效。如重复检测结果仍为无效，请与技术支持人员联系。
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