对虾白斑综合症病毒（WSSV）核酸检测试剂盒（一管式PCR-荧光探针法）使用说明

对虾白斑综合症病毒（WSSV）核酸检测试剂盒（一管式PCR-荧光探针法）

◆ 产品说明 

动物病害检测系列可针对食品、动物组织等样品中病原的特异核酸片段进行扩增，通过实时扩增曲线判定结果。本产品用于对对虾白斑综合症病毒（WSSV）的检测，检出限为10³copies/μL基因组DNA。

• 产品组成（96测试）

• 适用仪器

ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等实时荧光PCR仪。

◆ 自备耗材和仪器

    ①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；③离心机；④涡旋混匀器；⑤金属浴；⑥均质机、搅拌机或研钵等研磨器具；⑦电子天平。

◆ 注意事项

1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。

   1）第一区：样本制备区。

 2）第二区：模板添加区。

   3）第三区：扩增及产物分析区。

   ★ 分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。

2．实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。

3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。

4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。

5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。

6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。

◆ 样品处理

①样品的采集和制备是对虾白斑综合症病毒检测的重要步骤，为防止交叉污染，应使用一次性消耗品，研钵应经160℃干烤2 h，其他不宜干烤或高压处理的器皿应使用1%次氯酸钠溶液浸泡。②优先采集有症状的或活力差的个体。对于成虾取鳃或上皮、肝胰腺、肠、胃、游泳足或步足等病灶部位，活力差的个体采集10-20尾/池，活力好的个体至少多点采集150尾/池后混匀再随机抽检10-20尾。对于幼虾、仔虾、幼体或受精卵取整体，活力差的个体至少采集20尾/池，活力好的虾苗至少采集150尾/池。同一批样品，建议多点采集合并后，作为一份样品进行均质，提取DNA。③采样过程应快速完成，将采取的样品放入无菌均质袋中均质成糜状，充分混匀。更多样品前处理的注意事项可咨询我司技术支持人员。

• 实验操作

1.模板制备（样本制备区）

建议使用配套水生动物病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒系列产品，具体过程详见产品说明书。

2.添加模板（模板添加区，放置于冰盒上进行）

剪下所需测试数的已含有反应液的PCR管，放置在室温待解冻后，离心30秒后揭开封口膜，向每管反应液中分别加入5μL模板，顺序为NG、待测样品模板、PG-VH-P。盖好配套的PCR管盖后，涡旋混匀30s，离心1min，立即进行PCR扩增反应。

3. 扩增反应（扩增及产物分析区）

使用荧光定量PCR仪，荧光基团选择FAM，淬灭基团选择TAMRA。

按下列条件设置扩增反应：

其他仪器请参照仪器说明书进行设置。

• 结果判定

检测样品无Ct值或≥40，曲线为直线或轻微斜线，无“S”型扩增曲线，可报告样品阴性，不含有对虾白斑综合症病毒（WSSV）或含量低于检出限；

检测样品Ct≤36，曲线呈“S”型扩增曲线，可直接报告样品阳性，含有对虾白斑综合症病毒（WSSV）；

检测样品36<Ct≤40，需进行一次重复实验，若Ct值仍处于36和40之间且呈“S”型扩增曲线，同时阴性对照无Ct值，报告样品阳性，否则报告样品阴性。

• NG反应为平滑直线，PG反应为“S”型扩增曲线，此次检测结果有效，否则无效。如重复检测结果仍为无效，请与技术支持人员联系。
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