多重荧光western blot--注意事项

Azure Biosystems公司，我们非常相信荧光多重在Western印迹中的强大功能，这促使了我们的Azure C系列成像仪快速发展。 但是我们认识到，从标准的HRP /化学发光方法迈出来是有些艰巨的，所以我们提出了6个注意事项，使化学发光转换到荧光westernblot尽可能简单。

我们还在我们的一些以前的应用中详细介绍了相关内容，例如磷酸/总蛋白检测等等

1.增加浓度 - 与化学发光Western blot相比，所需的一抗和二次抗体的浓度可能会增加，这也取决于您使用的成像仪系统。 在更现代或激光成像器中，这种影响可能不太明显。

2.首先进行单色实验测试 - 首先单独测试您的抗体非常有意义。 这样，您可以确定最佳浓度，在简单的环境中可以把背景或非特异性的因素考虑进去，而不是一次性分析3种不同的一抗和二抗

3. 使用吸附性二抗 - 虽然听起来很简单，但许多人并不考虑他们现在将多种抗体、多个物种加入到单一的印迹中。 如果您在其他领域使用多种荧光，您将已经意识到二抗的交叉吸附，减少物种间交叉反应性的重要性。 但在western中，很多人并不考虑，这是值得检查的，以确保他们达到要求。

4. 扩展光谱 - 三色western blot是令人兴奋，那五种颜色呢。 使用NIR功能，可以大大增加区分不同峰。 显然，这可能需要一些工作进行抗体优化，一次用于5个蛋白的检测可以节省时间和成本花费。

5. 检查您的印迹膜 - 尽管越来越多的荧光安全膜正在开发中，但一些膜在UV光源暴露下发出自发荧光产生高背景信号。 我们还建议为增加灵敏度，建议从NC膜切换到PVDF膜上，如前所述。

6. 为您的蛋白选择合适的通道 - 所有的检测通道都不是平等创建的。 对于标准荧光，使用蓝色通道检测您的最高丰度蛋白质，绿色通道检测中等丰度蛋白和红色通道检测低丰度蛋白质。 如果使用NIR，可获得极好的灵敏度和低背景也是低丰度蛋白质的理想选择。

如果您遵循这些提示，并阅读我们的一些应用指南，则从单一到多通道的转变应该非常顺利，如果遇到任何困难，我们随时准备为您提供技术支持。