血液乙酰胆碱酯酶活性比色法定量检测试剂盒使用说明

血液乙酰胆碱酯酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

血液乙酰胆碱酯酶活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过乙酰胆碱酯酶反应系统中释放出巯基胆碱，使用Ellman试剂后，产生黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物，出现吸光峰值的变化，即采用比色法来测定血液样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物和人体血液样品（血浆、血清、红细胞等）乙酰胆碱酯酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

 

技术背景

乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase；AchE；EC3.1.1.7），又称为红细胞胆碱酯酶（RBC cholinesterase），广泛存在于真核生物，包括某些植物，尤其在脑组织、神经肌肉连接处（neuromuscular junction）、中枢神经系统的胆碱能突触（cholinergic synapses）和红细胞膜上高度表达，催化主要的神经传导介质乙酰胆碱的水解反应，产生乙酸和胆碱，终止突触传导。其功能在于调节乙酰胆碱作用。神经毒气，例如有机磷沙林（Sarin），抑制乙酰胆碱酯酶活性，导致神经肌肉瘫痪，最终发生窒息（asphyxiation）。血清乙酰胆碱酯酶浓度显著降低与有机磷杀虫剂中毒有关，因此血液检测是环境污染的重要指标。基于人工合成底物碘化硫代乙酰胆碱（acetylthiocholine iodide）在乙酰胆碱酯酶的作用下，水解产生乙酸和硫代胆碱（thiocholine），与Ellman试剂5,5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反应后，产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通过其吸收峰值的变化（412nm波长），来定量分析乙酰胆碱酯酶的活性。乙酰胆碱酯酶反应系统为：

    Acetylcholinesterase 

acetylthiocholine iodide        →      acetate  +  thiocholine

                             

DTNB  +  thiocholine  →   TNB +  choline-S-S-TNB

 

产品内容

清理液（Reagent A） 120毫升

裂解液（Reagent B）  10毫升

缓冲液（Reagent C）  40毫升

反应液（Reagent D）   2毫升

底物液（Reagent E）        4毫升

阴性液（Reagent F）     2毫升

产品说明书      1份

 

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

（微型）台式离心机：用于样品制备

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

 

实验步骤

• 样品准备

选择一：血浆样品

• 准备好肝素、ACD或EDTA等抗凝管
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血浆成分（注意：避免触碰白色液体层）
• 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存
• （选择步骤）移取10微升进行蛋白定量测定 （注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

 

选择二：血清样品

1． 准备好不含抗凝剂的储存管 

• 抽取1毫升血液，置于储存管里
• 室温下，静置30分钟，直至血液凝结
• 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血清成分（注意：避免触碰白色液体层）
• 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存
• （选择步骤）移取10微升进行蛋白定量测定 （注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

 

选择三：红细胞样品

• 准备好肝素、ACD或EDTA等抗凝管
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 转移到15毫升锥形离心管
• 放进4℃台式离心机离心30分钟，速度为200g（或1000RPM，例如eppendorf 5815）
• 小心抽去上清液
• 加入2毫升清理液（Reagent A），混匀
• 放进4℃台式离心机离心7分钟，速度为1200g（或2500RPM，例如eppendorf 5815）
• 小心抽去上清液
• 重复实验步骤6至8二次
• 加入2毫升预冷的裂解液（Reagent B）
• 涡旋震荡15秒
• 放进4℃台式离心机离心7分钟，速度为1200g（或2500RPM，例如eppendorf 5815）
• 小心移取上清液到新的15毫升离心管
• 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存
• （选择步骤）移取10微升进行蛋白定量测定 （注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

 

• 测定准备

 

• 开启并设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长412nm，间隔5分钟，读数3次（共15分钟），并置零
• 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照

• 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度；底物液（Reagent E）50℃温育溶解

 

• 样品背景对照测定

 

• 移取750微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升阴性液（Reagent F）
• 加入100微升底物液（Reagent E）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在37℃温度下孵育3分钟
• 加入50微升待测样品（100微克蛋白）（注意：样品须清澈） 
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品背景对照（15分钟读数－0分钟读数）

 

• 样品测定

 

• 移取750微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升反应液（Reagent D）
• 加入100微升底物液（Reagent E）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在37℃温度下孵育3分钟
• 加入50微升待测样品（100微克蛋白）（注意：样品须清澈）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（15分钟读数－0分钟读数）

 

五、计算样品活性

 

[（样品读数－背景读数）X 1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.05（样品容量；毫升）X 13.6（毫摩尔吸光系数）X 15（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

 

单位＝微摩尔硫代胆碱/分钟

 

酶标仪测定

在96孔板上做好相应标记：样品背景对照和待测样品

• 分别移取190微升缓冲液（Reagent C）到96孔板里
• 加入25微升阴性液（Reagent F）到样品背景对照孔里
• 加入25微升反应液（Reagent D）到待测样品孔里
• 分别加入25微升底物液（Reagent E）到所有孔里
• 轻轻摇动96孔板
• 在37℃温度下孵育3分钟
• 分别加入10微升待测样品（20微克蛋白）到所有孔里（注意：样品须清澈）
• 轻轻摇动96孔板
• 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和15分钟读数

 

[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.25（体系容量；毫升）]÷[0.01（样品容量；毫升）X 13.6（毫摩尔吸光系数）X 0.6（光径距离；厘米）X 15（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

 

单位＝微摩尔硫代胆碱/分钟

注意事项

 

• 本产品为20次（比色皿）和80次（96孔板）操作 
• 操作时，须戴手套
• 每个样品均须背景测定
• 建议使用比色皿测定
• 样品须澄清，至关重要
• 加样后3秒内比色测定
• 测定值由低到高变化；测定可持续15分钟
• 比色测定后，比色皿须清洗彻底
• 样本测定15分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性
• 建议待测样本蛋白浓度为100微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 乙酰胆碱酯酶单位活性定义为：在37℃，pH 7.5条件下，每分钟内能够生成1微摩尔硫代胆碱所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列乙酰胆碱酯酶检测试剂产品

质量标准

 

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感