组织谷氨酸丙酮酸转氨酶（GPT）活性酶偶联反应光谱法定量检测试剂盒使用说明

组织谷氨酸丙酮酸转氨酶（GPT）活性酶偶联反应光谱法定量检测试剂盒

产品说明书（中文版）

主要用途

组织谷氨酸丙酮酸转氨酶（GPT）活性酶偶联反应光谱法定量检测试剂是一种旨在通过谷氨酸丙酮酸转氨酶和乳酸脱氢酶的酶偶联反应系统中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后吸光峰值的降低，即采用光谱法来测定组织裂解样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物组织裂解悬液样品谷氨酸丙酮酸转氨酶的总活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

 

技术背景

 

谷氨酸丙酮酸转氨酶（glutamic pyruvic transaminase；GPT；EC2.6.1.2），又称为丙氨酸转氨酶（Alanine transaminase；ALT或alanine aminotransferase；ALAT），存在于各种人体组织和血液中。谷氨酸丙酮酸转氨酶催化丙氨酸的氨基转移到α-酮戊二酸（α- Ketoglutarate）的反应，产生丙酮酸和谷氨酸。检测谷氨酸丙酮酸转氨酶活性，常用于评价肝功能：GPT活性异常与病毒性肝炎、充血性心衰、肝损伤、胆道疾病、传染性单核细胞症有关。基于底物丙氨酸（L-alanine）和α-酮戊二酸，在谷氨酸丙酮酸转氨酶的催化作用下，转化成丙酮酸后，通过乳酸脱氢酶系统，测定还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）的吸光峰值变化（340nm 波长），来定量分析谷氨酸丙酮酸转氨酶的活性。其反应系统为：

 

Alanine aminotransferase/glutamate pyruvate transaminase

α-Ketoglutarate  +  L-alanine       →      pyruvate  +  L-glutamate

         

Lactate dehydrogenase

Pyruvate  +  NADH       →      Lactate  +  NAD⁺   +  H⁺

        （高吸收峰）    （低吸收峰）

 

产品内容

 

清理液（Reagent A）  60毫升

裂解液（Reagent B）  10毫升

缓冲液（Reagent C）  20毫升

反应液（Reagent D）   2毫升

底物液（Reagent E）     2毫升

阴性液（Reagent F）   500微升

产品说明书      1份

 

 

 

 

保存方式

 

保存裂解液（Reagent B）、反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

 

用户自备

 

1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

（微型）台式离心机：用于样品操作

比色皿或96孔板：用于光谱分析的容器

分光光度仪或酶标仪：用于光谱分析

 

实验步骤

 

• 样品准备

 

• 手术取出动物组织，并秤重以确定500毫克组织重量 
• （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
• （选择步骤）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一个液氮冻存管
• 即刻放进液氮罐过夜
• 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
• 放进一个15毫升锥形离心管
• 加入预冷的500微升裂解液（Reagent B） 
• 转移到预冷的1.5毫升离心管
• 强力涡旋震荡30秒，充分混匀
• 置于冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）
• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

 

• 测定准备

 

• 准备好待测样品（例如组织裂解萃取悬液样品等），置于冰槽里
• 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长340nm，间隔60秒，读数6次（共5分钟），并置零
• 测定开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）置入冰槽里融化。缓冲液（Reagent A）在30℃温度下均衡温度

 

 

 

• 背景对照测定

 

• 移取750微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升反应液（Reagent D）
• 加入100微升底物液（Reagent E）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在30℃温度下孵育3分钟
• 加入20微升阴性液（Reagent F）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（0分钟读数－5分钟读数）

 

• 样品测定

 

• 移取750微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升反应液（Reagent D）
• 加入100微升底物液（Reagent E）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在30℃温度下孵育3分钟
• 加入50微升待测样品（50微克组织裂解悬液总蛋白）（注意：样品须清澈，且pH为7.5）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（0分钟读数－5分钟读数） 

 

五、计算样品活性

 

[（样品读数－背景读数）X 1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.05（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 5（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

 

单位＝微摩尔NADH/分钟

 

• 酶标仪测定

 

• 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
• 分别移取190微升缓冲液（Reagent C）到相应孔里
• 分别加入25微升反应液（Reagent D）
• 分别加入25微升底物液（Reagent E）
• 轻轻摇动96孔板
• 在30℃温度下孵育3分钟
• 分别加入10微升阴性液（Reagent F）或待测样品（20微克组织裂解悬液总蛋白）（注意：样品须清澈，且pH为7.5）
• 轻轻摇动96孔板
• 即刻放进酶标仪检测，包括（0分钟初始读数和5分钟读数）
• 活性计算

 

[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.25（体系容量；毫升）]÷[0.010（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 0.6（光径距离；厘米）X 5（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

 

单位＝微摩尔NADH/分钟

 

注意事项

 

• 本产品为20次（比色皿）和80次（96孔板）操作，包括背景对照
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 样品须澄清，至关重要
• 建议使用比色皿测定
• 加样后3秒内光谱测定
• 测定值由高到低变化；测定可持续5分钟
• 光谱测定后，比色皿须清洗彻底
• 背景空对照0分钟读数通常0.5为理想状态
• 背景空对照的正常读数差值（0分钟－5分钟）通常为0.001至0.005（正负即可）
• 样品0分钟读数通常和背景空对照0分钟读数一致
• 样本测定5分钟读数低于0分钟读数表明具有酶活性
• 建议待测样本蛋白浓度为50微克/50微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒30030.1）
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 谷氨酸丙酮酸转氨酶单位活性定义为：在30℃，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔NADH所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列细胞酶学检测试剂产品

 

质量标准

 

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感