全组织细胞色素氧化酶活性染色试剂盒使用说明

全组织细胞色素氧化酶活性染色试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

全组织细胞色素氧化酶活性染色试剂是一种旨在使用细胞色素C催化人工电子供体染料二氨基联苯胺的非酶源性自然氧化，形成棕褐色不溶性产物，来分析全组织样品中细胞色素氧化酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心改良传统NADI方法、成功实验证明的。主要适用于各种动物组织的细胞色素氧化酶活性的定性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，显色清晰。 

技术背景

细胞色素氧化酶（Cytochrome oxidase）是氧化呼吸链的酶部分的总称。其存在于真核生物的细胞线粒体上，主要通过氧化磷酸化为细胞提供能量。二氨基联苯胺（3,3’-diaminobenzidine，DAB）是人工电子供体染料，通过与金属蛋白，例如含铁蛋白细胞色素C中的物理性结合，产生非酶源性自然氧化，同时提供电子（细胞色素C作为电子受体）于呼吸链的电子传递系统，由此呈现出颜色变化和沉积，形成棕褐色不溶性产物，且不受乙醇影响。在DAB自然氧化的同时，产生活性氧，例如过氧化氢，由过氧化氢酶防止其聚集。在大量氧化型DAB的存在下，通过细胞色素氧化酶的作用，亚铁细胞色素C被氧化成正铁细胞色素C。由此氧化型DAB棕褐色不溶性产物被用于检测组织细胞中细胞色素氧化酶的活性。 

产品内容

清理液（Reagent A）  200毫升

染色液A（Reagent B1）   40毫升

染色液B（Reagent B2）    4瓶

反应液（Reagent C）    3毫升

固着液（Reagent D）   30毫升

产品说明书    1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）和反应液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于工作液配制的容器

培养箱：用于反应孵育

中性树脂：用于切片封片

光学显微镜：用于切片染色后观察分析

实验步骤

染色开始前，将－20℃冰箱里的试剂置于室温下融化；移取9毫升染色液A（Reagent B1）到1瓶染色液B（Reagent B2）里，混匀，标记为染色工作液，置于冰槽里备用，避免光照（注意：有效期1周）；继续移取2.7毫升染色工作液到新的1.5毫升离心管，加入300微升反应液（Reagent C），混匀后，标记为反应工作液，置于冰槽里，避免光照。然后进行下列操作。

• 准备1个6孔细胞培养板
• 放进新鲜切除的动物组织样本（注意：建议组织大小为0.5厘米厚，1厘米长；如果过大，最好刀切处理一下）
• 将组织压平
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），清洗组织样本
• 小心抽去清理液
• 小心加入3毫升反应工作液，浸没整个组织
• 放进37℃培养箱，孵育60分钟，避免光照
• 小心抽去反应工作液
• 小心加上3毫升清理液（Reagent A），清洗组织样本
• 小心抽去清理液
• 重复实验步骤9至10二次
• 小心加入3毫升固定液（Reagent D），浸没整个组织
• 在室温下孵育15分钟
• 小心抽去固定液
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），清洗组织样本
• 在室温下孵育15分钟
• 小心抽去清理液
• 重复实验步骤15至17二次
• 后续石蜡切片（6微米厚）或冰冻切片（10微米厚）
• 在光学显微镜下观察和计数：表达细胞色素氧化酶活性的组织细胞为阳性组织细胞，呈现棕色。

注意事项

• 本产品为10次操作
• 操作时，须戴手套
• 染色液（Reagent B）和反应液（Reagent C）避免反复冻融
• 染色工作液不宜久存，1周内使用为佳
• 阴性对照时，GENMEN反应工作液可含有叠氮化钠
• 每次更换试剂溶液时，保持切片面基本晾干
• 试剂溶液在切片表面时，避免有气泡存在，同时确保铺满切片表面
• 整个操作，在避光状态下进行
• 染色孵育时间，根据样品和酶活性强弱调整，通常为1至3小时
• 染色完成后，即刻进行光学显微镜观察 
• 样品染色后保存，避免光照
• 细胞色素氧化酶活性染色参考图像： 

本公司提供系列组织细胞酶活性染色试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定显色清晰