逆转录PCR两步法（RT-PCR）试剂盒产品说明书

逆转录PCR两步法（RT-PCR）试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

逆转录PCR两步法（RT-PCR）试剂是一种旨在通过逆转录酶（reverse transcriptase）的作用把RNA逆转录成cDNA后，采用体外扩增DNA的方法（PCR法），进行分析RNA构造的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于RNA分析、cDNA克隆、RNA表达等。尤其可用于低拷贝量的RNA样品。产品即到即用，性能稳定，严格无核酶污染，操作简便，逆转录效率和扩增产量皆高，重复性好。

技术背景

单链DNA结合蛋白（Single-Stranded DNA Binding Protein；SSB）用于改善逆转录酶（reverse transcriptase）的反应产物和作用效率。超能逆转录酶（Super reverse transcriptase）是一种DNA聚合酶，用于合成以单链RNA为模板的配对性DNA，并能最大限度地增加第一条链的cDNA的产量。RNA核酸酶抑制剂（RNAsin）具有广谱稳定的RNA酶抑制功能，用于高质量清除RNA酶污染。  

产品内容

引导液（Reagent A）    90微升

逆转液（Reagent B） 162微升

反应液（Reagent C） 600微升

补充液（Reagent D）      2毫升

产品说明书   1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；有效保证6月

用户自备

RNA样品：用于逆转录扩增的模板

PCR引物：用于逆转录的启动DNA片段

干式恒温仪：用于逆转录反应的孵育

0.5毫升PCR管：用于逆转录和PCR反应的容器

涡旋震荡仪：用于反应物混匀

微型台式离心机：用于样品操作

PCR扩增仪：用于核酸产物扩增

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的引导液（Reagent A）、逆转液（Reagent B）、反应液（Reagent C）和补充液（Reagent D），以及用户自备的RNA样品和引物置入冰槽里融化；同时将干式恒温仪分别设置到70℃和37℃。然后进行下列操作。

第一步：cDNA合成

• 分别将融化的试剂盒里的试剂溶液涡旋震荡2秒
• 放进微型台式离心机瞬时离心5秒
• 移出4.5微升引导液（Reagent A）到新的0.5毫升PCR管
• 加入8微升用户自备的RNA样品（5微克总RNA或0.25微克POLY A+ RNA）
• 用枪头混匀
• 放进70℃干式恒温仪孵育3分钟
• 即刻放进冰槽里
• 加入8微升逆转液（Reagent B）
• 用枪头混匀
• 放进微型台式离心机瞬时离心5秒
• 放进37℃干式恒温仪孵育60分钟
• 即刻放进冰槽里
• 加入80微升补充液（Reagent D）稀释，混匀
• 置入冰槽里备用或放进－20℃冰箱里保存

第二步：cDNA扩增

• 移出30微升反应液（Reagent C）到新的0.5毫升PCR管
• 加入用户自备的引物F和R（分别总量为350纳克）
• 加入2微升上述稀释的cDNA合成物
• 最后加入补充液（Reagent D）到总量50微升，混匀
• 放进4℃微型台式离心机瞬时离心5秒
• 使用1000微升枪头加入2滴矿物油（注意：参见注意事项6）
• 放进PCR扩增仪，PCR反应程序为：

• PCR产物置于－20℃冰箱里保存，直到进行任何后续实验
• 进行琼脂糖凝胶电泳分析

注意事项

• 本产品为20次操作
• 整个操作须在4℃状态下进行
• 避免反复冻融
• 整个操作须戴手套，建议使用滤芯枪头，并格外小心，防止降解RNA
• 建议所有的操作用品属于RNA专用
• 建议使用5微克总RNA样品量；为了确保获得满意效果，不要低于500纳克
• 根据用户PCR仪的性能，决定是否加入矿物油（Mineral Oil）
• 根据Tm=4（G+C）+2（A+T）公式确定Tm温度；建议使用分析软件
• 本公司提供系列RT－PCR产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定严格无核酶污染
• 本产品经鉴定反应产量高