借助电转方法将Cas9蛋白质/sgRNA导入小鼠原核受精卵生成非嵌合体突变体
胚胎基因编辑解析：借助电转方法将Cas9蛋白质/sgRNA导入小鼠原核受精卵生成非嵌合体突变体
基因编辑技术指能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。
应用方向
- 基因敲除：如果想使某个基因的功能丧失，可以在这个基因上产生DSB，非同源末端连接（NHEJ）修复的过程中往往会产生DNA的插入或删除（indel），造成移码突变，从而实现基因敲除。
- 特异突变引入：如果想把某个特异的突变引入到基因组上，需要通过同源重组来实现，这时候要提供一个含有特异突变同源模版。正常情况下同源重组效率非常低，而在这个位点产生DSB会极大的提高重组效率，从而实现特异突变的引入。
- 定点转基因：与特异突变引入的原理一样，在同源模版中间加入一个转基因，这个转基因在DSB修复过程中会被拷贝到基因组中，从而实现定点转基因。通过定点转基因的方法可以把基因插入到人的基因组AAVS1位点，这个位点是一个开放位点，支持转基因长期稳定的表达，破坏这个位点对细胞没有不良影响，因此被广泛利用。
下面这篇文章就是针对第三个应用方向的成功阐述。
借助电转方法将Cas9蛋白质/sgRNA导入小鼠原核受精卵生成非嵌合体突变体
摘要
CRISPR/Cas9系统被广泛应用于各种有机体，特别是小鼠，用来阐明基因的作用。为了获得优化的小鼠胚胎，Cas9 mRNA和sgRNA通常通过注射或是电转导入受精卵。然而，由此种方法生成的大多数突变体都是嵌合体，包含不同类型的突变体，导致复杂的表型分析。为了使基因功能分析更加简化，急迫的需要寻找一种生成非嵌合体突变体的方法。这里，我们确定了一种方法，可以生成非嵌合体小鼠突变体胚胎。我们通过电转化同时导入Cas9蛋白质和sgRNA 入离体小鼠受精卵。确保基因编辑发生在小鼠基因组的第一次复制之前。结果，所有细胞都携带相似的突变体表现型。这个方法解决了利用CRISPR/Cas9系统产生的嵌合体突变体的问题。
材料与方法
电转化
CUY21 EDIT II和LF501PT1-10 铂金盘电极（长：10mm，宽：3mm，高：0.5mm，gap：1mm）(BEX Co. Ltd., Tokyo, Japan)用于电转化。
电极连接在电转化仪上，另一端连接在体式显微镜下。30-40个来自于交配受孕或体外受孕的受精卵同时进行电转染。受精卵培养在KSOM培养基内，用Opti-MEM I 清洗三遍，去掉血清，在电极的槽内纵向排列成一条直线，并添加5uL Opti-MEM I，并加入Cas9蛋白质和sgRNA或mcherry mRNA。电转条件是30V （3ms 脉冲时长+97ms间隔）7个cycle。电转后，受精卵立即从电击槽中取出，分别用M2培养基洗4次、KSOM培养基洗2次。随后受精卵培养在37℃,5%CO2培养箱内，直至出现二细胞阶段。
结果
图 通过电转化Cas9蛋白质和sgRNA生成Fgf10突变体胚胎。（a）Fgf10基因和sgRNA靶序列。（b）电转化发生的时间。电转发生在体外受孕后5h。交配受孕受精卵电转发生在E0.5。（c）代表胚胎展示了不同的肢体表现型：T1（没四肢）T2（肢体缺陷，无前肢或无后肢）。Control受到电击，但是没有转入Cas9蛋白和RNA。
总结
我们阐述了这种方法，将Cas9蛋白质和sgRNA转入体外受精的卵细胞中，生成突变体。在DNA第一次复制前，通过NHEJ-介导的缺失插入或是HDR-介导的基因插入，生成嵌合度较低的突变小鼠。我们的电转方法对构建转基因模式小鼠非常有效。
文章出处
Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 2016
