Q Exactive Focus 结合 Compound Discoverer实现泮托拉唑杂质谱分析
药物杂质鉴定新流程 — Q Exactive Focus 结合 Compound Discoverer 实现泮托拉唑杂质谱分析
关键词
药物杂质鉴定；Compound Discoverer；Q Exactive Focus；静 电场轨道阱高分辨质谱
1.引言
任何影响药物纯度的物质统称为杂质。人用药物注册技术要求 国际协调会（简称 ICH）对杂质的定义为药物中存在的，化学 结构与该药物不一致的任何成分。药物中含有杂质会降低疗 效，影响药物的稳定性，有的甚至对人体健康有害或产生其他 毒副作用。因此，检测有关物质，控制纯度对确保用药安全有 效，对保证药物质量非常重要。
质谱技术因其快速、高灵敏度和高专属性的分析能力，已经被广泛的应用于药物杂质鉴定，OrbitrapTM 静电场轨道阱高分辨 质谱具有超高的分辨率和长期稳定的高质量精度，可获得高质 量的一级和多级高分辨质谱数据，保证了鉴定结果的可靠性， 被越来越多的应用于定性分析中。
本文采用Thermo ScientificTM高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱 Q Exactive™ Focus 高分辨质谱联用技术对药物泮托拉唑进行 了全面的杂质数据采集，利用高性能四极杆对目标化合物进行 高专属性选择，HCD 高能碰撞池进行二级碰撞碎裂，Orbitrap 静电场轨道阱采集一级和二级高分辨质谱数据。结合 Thermo 新一代的智能小分子化合物分析软件 Compound Discoverer™， 以高度灵活的自定义方式制定了泮托拉唑杂质分析工作流程（ 图 1）。
图 1. 基于 Q Exactive Focus 和 Compound Discoverer 的杂质鉴定流程
2.实验条件
2.1 液相色谱条件：
仪器：Thermo ScientificTM UltiMateTM 3000 超高效液相色谱仪
色谱柱：Hypersil Gold C18 (100×2.1 mm, 1.9 µm)
流动相：A 为水相：0.1% 甲酸水；B为有机相：乙腈
梯度条件：
2.2 质谱条件
仪器：Thermo ScientificTM Q Exactive Focus 四极杆静电场轨道阱 高分辨串联质谱。HESI 离子源参数：Spray Voltage +3.5 KV、2.8 KV，快速正负切换；Sheath Gas Pressure: 40arb；Aux Gas Pressure: 10arb；Capillary Temp: 300℃；Heater Temp: 350℃
质谱扫描参数：全扫描范围 150–800 m/z，分辨率 70,000 FWHM；二级：Discovery 数据依赖自动触发；母离子隔离窗 口 0.4 amu、4.0 amu；分辨率 17,500、70,000 FWHM。
2.3 样品制备
取泮托拉唑影响因素样品适量，加乙腈：水（50:50）稀释至 0.2 mg/mL 后进样分析。
3．结果
3.1 Q Exactive Focus 提供优质、全面、高效的原始数据
3.1.1 快速正负切换提升化合物鉴定覆盖率
Q Exactive Focus 具有快速、高效的正负切换能力。以图 2 中 7.16 min 的色谱峰为例，正离子模式下检测到 336.11500 m/z 杂质的 [M+H]+ 信号，在负离子模式下除了检测到相应的 334.10177 m/z [M-H]- 信号外，还检测到另一杂质 320.08543 m/z 的 [M'-H]- 信号，表明快速的正负切换采集模式可以同时 获得正离子和负离子杂质的全面信息，同时由图 1 质量偏差可 见，无论是正离子还是负离子模式，Q Exactive Focus 都能保 持优秀的质量精度，为准确鉴定提供了有力的保障。
图 2. 快速正负切换检测不同性质杂质
3.1.2 更精准的四极杆隔离母离子提升二级谱图特征性
在做二级碎裂时，需要使用四极杆筛选出母离子，送入碰撞池碰撞碎裂，进而获得二级高分辨质谱图，Q Exactive Focus 采用高性 能双曲面四极杆，具有低至 0.4 amu 的母离子选择能力，图 3 比较了不同母离子隔离宽度下杂质 367 m/z 的二级质谱情况，在 4.0 amu 隔离宽度下存在 122、152、184、368 m/z 等离子的诸多干扰，而当隔离宽度缩小到 0.4 amu 时，干扰被有效的去除，同时 从二级质谱响应强度来看，采用 0.4 amu 和 4.0 amu 无明显差别。表明高性能四极杆能够在不影响灵敏度的情况下通过提高四极 杆分辨率，更准确的选择母离子，获得更特征的二级质谱图，提高准确鉴定率。
图 3. 不同隔离宽度下二级质谱数据比对
3.1.3 超高分辨率下获得特征同位素信息
当质谱的分辨率高到一定程度时，化合物的同位素峰会进一步分离，以泮托拉唑为例（图 4），在 Q Exactive Focus 高达 70,000 FWHM 的分辨率下，一级质谱中 A2 同位素中的 34S 和 18O+13C2 能得到分离，通过过滤 34S 特征同位素信号，可以从总离子 流图中筛选出含有 S 元素的泮托拉唑有关物质信号，更有针对性的对有关物质进行鉴定。
图 4. 分辨率 70,000 FWHM 下泮托拉唑 34S 同位素峰分离和过滤结果
3.2 Compound Discoverer 数据处理软件发现及鉴定目标和未知杂质
3.2.1 智能样品分组比较不同批次样品
Compound Discoverer 可以针对不同项目建立特定的研究程式，在泮托拉唑研究描述中，输入针对该项目的分析条件；在研究因 子中根据样品性质，设立高温、高湿、常规条件等三个分类因素；根据分类因素分别对导入的样品进行定义，进而软件可以进行 智能分组（图 5）。
图 5. Compound Discoverer 泮托拉唑研究程式
3.2.2 灵活自定义的已知和未知杂质数据处理流程
在 Compound Discoverer 工作流程树中可以根据研究需要，灵活的编辑数据处理的流程。对泮托拉唑的杂质分析，分别采用已知 和未知两条主要流程对可能存在的预期杂质和未知杂质进行提取处理分析（图 6）。
图 6. 杂质分析工作流程树
3.2.3 杂质提取分析结果快速浏览
在 Compound Discoverer 处理结果汇总峰列表中，可以直观、便捷的查看和筛选预期和未知的杂质峰处理结果，从结果界面中可 以直观的比对不同影响因素样品下该杂质的提取离子流图，进而比较其保留时间及响应情况；在质谱图中可以评估一级质谱的质 量精度与同位素和理论值的匹配情况（图 7）。
图 7. 数据处理结果界面
3.2.4 未知杂质碎片分析和鉴定
在获得母药和杂质的一级和二级质谱信息后，软件将调用碎裂数据库（Fragmentation Library）快速的对泮托拉唑的碎片结构进行 归属，该数据库几乎涵盖了所有已发表的文献，保证了碎片解析的准确性。在此研究结果之上，通过软件对杂质与泮托拉唑二级 质谱信息之间的比对，可进一步对杂质变化位点进行推测（图 8）。通过 152、185 等共有碎片和 200、216 等特征差异碎片的比 对，推测出该杂质为泮托拉唑砜（图 9）。
图 8. 二级质谱碎片归属比对结果
图 9. 杂质泮托拉唑砜
3.3 泮托拉唑杂质分析结果
使用上述解析流程，共检测到泮托拉唑杂质 15 个，其中可能的降解杂质 9 个，可能的工艺杂质 6 个（图 10）。
图 10. 泮托拉唑杂质分类及鉴定结果汇总
4. 小结
4.1 Q Exactive Focus 质谱仪将高性能四极杆与高分辨静电场 轨道阱 Orbitrap 检测技术相结合，能够在保持高质量精度和 灵敏度的前提下进行快速的正负切换，获得最全面的杂质信 息。高性能四极杆能够准确快速的筛选母离子，进而获得高 专属性的纯净二级质谱图。Orbitrap 技术具备高分辨高质量精 度（HR/AM）的能力，本实验中泮托拉唑杂质质量偏差 < 1.5 ppm，能够准确的生成杂质元素组成，70,000 FWHM 的超高 分辨率可以分辨 A2 同位素中的 34S 和 18O+13C2，更有针对性的 对含 S 有关物质进行鉴定。
4.2 Compound Discoverer 为 Thermo 新一代的智能小分子化 合物鉴定软件，可针对不同项目建立特定的研究程式。根据 预设的分类因子，对不同影响因素放置条件下的样品进行便捷 的分组；根据研究需要设定自定义的工作流程树，对预期的 可能杂质和未知杂质进行提取分析；并在结果浏览中直观的获 得不同条件下样品差异比对结果。通过调用丰富的碎裂数据 （Fragmentation Library），可快速的对泮托拉唑碎片结构进 行了准确推测和归属，通过对杂质与泮托拉唑二级质谱信息之 间的比对分析，可进一步对杂质变化位点进行推测，最终获得全面的杂质鉴定结果。
