高效液相色谱串联质谱法测定血浆中的替加环素
高效液相色谱串联质谱法测定血浆中的替加环素
周 亮
赛默飞世尔科技（中国）有限公司
1.引言
替加环素（Tigecycline）又名9- 叔丁基甘氨酰胺基米诺环素、丁甘米诺环素，是首个被批准用于临床的静脉内给药的甘氨酰四环素类抗生素，具有超广谱的抗菌活性，包括革兰氏阳性和革兰氏阴性的好氧菌及厌氧菌等临床分离的重要致病菌。替加环素的作用机制与四环素类抗生素相似，都是通过与细菌30S 核糖体结合，阻止转移RNA的进入，使得氨基酸无法结合成肽链，最终起到阻断细菌蛋白质合成，限制细菌生长的作用。替加环素能够克服或限制细菌的外排泵和核糖体保护两种耐药机制的作用，不易产生耐药性，其广泛的组织分布和较长的清除半衰期的药动学性质令人乐观；同时对于肾功能紊乱及需进行血液透析的患者，不必进行剂量和时间上的调整。2005 年6 月美国FDA 批准用于成人复杂皮肤及软组织感染和成人复杂的腹内感染，但在国内尚处于临床研究、申报生产阶段。
本实验建立了测定血浆中替加环素的LCMSMS 方法，采用适当的样品前处理方法，血浆中的杂质不干扰样品的测定，具有灵敏度高，重现性较好等特点。
2．实验部分
2.1 仪器与试剂：
TSQ Vantage 三重四极杆串联质谱仪（赛默飞世尔科技Thermo Fisher Scientific 公司），配置有电喷雾电离源（ESI）；Dionex Ultimate 3000 RSLC 超高压液相色谱。
标准品：替加环素和内标盐酸四环素纯度均大于98％，信息见表1。用甲醇溶解并配制成1.0 mg/mL 标准储备液，再根据需要稀释成适当浓度的混合标准工作液。其他试剂均为HPLC 色谱纯。
表1. 待测化合物信息
2.2 仪器方法：
2.2.1 液相条件：
色谱柱：Hypersil GOLD C18，100mm×2.1mm；
梯度洗脱程序见表2，进样量5μL。
表2. 液相色谱梯度条件
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时间/min |
水(0.2%甲酸+5mM甲酸铵) |
乙腈 |
流速/μL/min |
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0.00 |
95 |
5 |
400 |
|
3.00 |
20 |
80 |
400 |
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3.50 |
20 |
80 |
400 |
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3.60 |
95 |
5 |
400 |
|
5.00 |
95 |
5 |
400 |
2.2.2 质谱条件：
电喷雾电离源（ESI），正离子模式；选择反应监控（SRM）扫描模式，喷雾电压：3000V；气化器温度320℃，离子传输管温度：350℃；氮气作为鞘气和辅助气，其中鞘气为35arb，辅助气为10arb，氩气用作碰撞气, 碰撞压力为1.5mTorr；选择反应监测（SRM），离子对信息见表3。
表3. SRM 模式中的离子对信息
其中，替加环素选取m/z 513.2，四环素选取m/z 410.2 的离子作为定量离子。
2.3 血浆样品处理方法：
向0.2mL 血浆中加入10μL 内标液（100ng/mL 四环素溶液），加入100μL20% 三氯乙酸（TCA） 沉淀蛋白， 涡旋混合1min，离心10min（13000r/min），取5μL 上清液进样分析。
3. 方法学验证结果分析
3.1 特异性：
本实验所用的检测条件下，替加环素在1.98min 左右出峰，内标四环素在2.49min 左右出峰，峰形良好，无杂质峰干扰测定，基线平稳（见图1）。本方法具有较高的特异性，能准确测定血浆中替加环素的浓度，灵敏度较高。
图1. 血浆中替加环素及内标四环素的色谱图
（A-F）：6个不同来源的空白血浆的色谱图；
（G）：空白血浆加入已知浓度替加环素和四环素的色谱图
3.2 最低检出限（LLOD）
取10μL 替加环素标准溶液加入到空白血浆中，配成0.2mL的浓度为100ppt 的标准含药血浆，按“血浆样品处理”项下操作，记录色谱图，得到替加环素血浆基质前加标的最低检出限，S/N=6，结果图2。
图2. 替加环素LLOD 的色谱图
3.3标准曲线和定量范围
将1mg/mL 替加环素溶液逐级稀释成一系列浓度，分别取10μL 加入到空白血浆中，配成0.2mL 的浓度分别为5,10,50,100,500,1000,2000ppb 的标准含药血浆，按“血浆样品处理”项下操作，记录各标准点和内标的峰面积，以浓度为横坐标，分析物与内标的峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归计算，求得直线回归方程即为标准曲线，平行操作3 次，结果见表4，图3。
表4. 替加环素标准曲线（n=3）
图3. 替加环素标准曲线图
3.4 精密度和准确度
分别取不同量的替加环素加入到空白血浆中，配成0.2mL的浓度分别为10，100，1600ppb 的标准含药血浆，按“血浆样品处理”项下操作，在批内和批间对每种浓度各做5份样品，记录色谱图，计算浓度，求得批内和批间精密度，结果见表5。
表5. 血浆中替加环素日内和日间精密度（n=5）
分别取不同量的替加环素加入到空白血浆中，配成0.2mL的浓度分别为10，100，1600ppb 的标准含药血浆，按“血浆样品处理”项下操作，在日内和日间对每种浓度各做5 份样品，记录色谱图，计算浓度，并与加入的标准浓度比较，结果见表6。
表6. 血浆中替加环素准确度（n=5）
3.5 稳定性
分别取不同量的替加环素加入到空白血浆中，配成0.2mL的浓度分别为10，100，1600ppb 的标准含药血浆，按“血浆样品处理”项下操作，对每种浓度各做25 份样品，5份处理后在自动进样器中放置24h；5 份在室温放置4h 后按“血浆样品处理”项下操作，进样分析；5 份于配制好后-20℃冷冻后取出自然解冻，再冷冻再解融（反复冻融3 个循环）后按“血浆样品处理”项下进样分析；5 份在-80℃冷冻两周后按“血浆样品处理”项下操作，进样分析；5份在-80℃冷冻四周后按“血浆样品处理”项下操作，进样分析，结果见表7。
表7. 血浆中替加环素的稳定性（n=5）
3.6 回收率
分别取不同量的替加环素加入到空白血浆中，配成0.2mL的浓度分别为10，100，1600ppb 的标准含药血浆，按“血浆样品处理”项下操作，记录样品峰面积与内标峰面积ƒx(ƒx=As'/Ai）；10，100，1600ppb 样品直接进样后记录峰面积与内标峰面积比值ƒs(ƒs=As/Ai）, 计算ƒx 和ƒs 的比值即得到替加环素的回收率，平行操作5 次，结果见表8。
表8. 血浆中替加环素的回收率（n=5）
4. 方法学小结
本实验建立了测定血浆中替加环素的LC-MS/MS 测定方法，采用适当的样品前处理方法，血浆中的杂质不干扰样品的测定，标准曲线线性范围为5ppb-2000ppb, 线性关系良好，最低定量限为5ppb；方法学确证的高、中、低三种浓度的批间和批内变异均小于10%；准确度为95.05%-102.35%；回收率为93.96%-105.63%；血浆中的替加环素在室温放置4h、反复冻融3 次、处理后的样品在自动进样器放置24h 以及在-80℃冰箱冷冻两周和四周，样品依然稳定，符合生物样品测定要求。
5. 血浆样品测定结果
受试者连续多次给予药物替加环素后，血浆中的替加环素浓度见表9。
表9. 受试者的替加环素血浆药物浓度
6. 结论：
TSQ Vantage 三重四极杆液质联用系统检测血浆中替加环素具有灵敏度高、特异性好的优点，检测限可以做到100ppb；该方法具有宽的线性范围（5ppb-2000ppb），良好的精密度和准确度；同时使用20% 的三氯乙酸沉淀蛋白的方法处理血浆样品，简单快捷，空白基质没有干扰，回收率可以达93.96%-105.63%，证明该方法检测血浆中的替加环素具有很好的适用性。
