环形细胞侵袭实验--使细胞侵袭的过程可视化

肿瘤细胞的侵袭能力是肿瘤转移的一个重要特征。为了研究肿瘤细胞侵袭过程的机制，一系列体外细胞实验建立起来，用于研究细胞侵袭基底膜和基质的过程。体外侵袭实验首先是采用人工重构基底膜材料Matrigel，可以在37℃逐渐凝固成胶，结构与天然基质膜结构极为相似。通常的实验是在孔径8μm的滤膜上铺上一层Matrigel，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过。实验之后通过对穿过“基质膜”的细胞进行计数，来确定细胞的侵袭能力。这一方法非常仿真的模拟了细胞在生理状态下的侵袭过程，但是其也有一定的局限性。由于滤膜的不透光性，使得直接观察细胞伪足和骨架变化变得非常困难。

英国的科研人员改进了肿瘤侵袭实验，设计了一种环形细胞侵袭实验，使得操作进一步简化，并且也能模拟3D侵袭。最重要的是，能够使侵袭过程中的活细胞或者是固定的细胞可视化。借用这个实验方法，研究人员发现侵袭过程中主要有蛋白酶参与其中。研究发现，在3D侵袭的细胞中蛋白酶会聚集在伪足和细胞的粘附点上。

Cells Assemble Invadopodia-Like Structures and Invade into Matrigel in a Matrix Metalloprotease Dependent Manner in the Circular Invasion Assay

X. Yu and L. M. Machesky

PLoS ONE, 2012, 10.1371/journal.pone.0030605

（一）实验材料

• 细胞:   MDA-MB-231
• 实验耗材:  伤口愈合插件         （ibidi，80209）

               玻璃底培养皿      （ibidi，81158） 

• 试剂:    Matrigel           （BD）

             4%多聚甲醛溶液

             0.1%Triton X-100

（二）实验步骤

• 将ibidi伤口愈合插件放入ibidi玻璃底培养皿中间
• 在插件外部铺 6 × 10⁵ MDA-MB-231细胞，等待细胞贴壁
• 细胞贴壁后移除伤口愈合插件，在细胞中心形成一个0.8cm²的空白区域
• 加入250μl的50% BD Matrigel （4.5mg/ml），将培养皿内层刚好铺满，能形成一个0.8mm厚度的“基质膜”
• 孵育2小时，使Matrigel完全固化，加入培养基
• 在37^。C培养箱中孵育24小时。
• 以4%多聚甲醛溶液固定30分钟，并以 0.1%Triton X-100通透30分钟后可以加入DAPI或者抗体染色

（三）实验结果

1、使用环形细胞侵袭实验能够观测到细胞侵袭中的活动（图一）

图一：MDA-MB-231细胞在环形细胞侵袭过程中形成了侵袭链：A）MDA-MB-231细胞在matrigel中形成了一个长的侵袭链 B）勤洗脸的免疫荧光图，红色为Actin，蓝色为细胞核。

2. 使用环形侵袭实验能够记录对比侵袭速率和侵袭面积（图二）

图二：MDA-MB-231细胞侵袭过程受MMP调控。加入25μM的GM6001能显著的减缓侵袭速率和侵袭面积。