细胞共培养--CD34前体干细胞对内皮细胞团的旁分泌影响

细胞共培养实验是将2种或2种以上的细胞共同培养在同一环境中的实验，更好的模拟体内细胞互相通信的生理情况。一般有两种共培养方法：1）直接接触共培养体系：是指直接将2种或2种以上的细胞按照一定比例混合，铺在一个孔中；2）间接接触共培养体系：是指将不同种类的细胞共用一种培养环境，而不互相接触，查看细胞分泌因子对另外的细胞的影响。这里我们介绍的是采用间接接触共培养的方法，研究CD34祖细胞的分泌物对由内皮细胞组成的细胞团在血管形成上的影响。

文中，研究人员将CD34祖细胞和内皮细胞团共培养后发现，CD34祖细胞使内皮细胞团血管生成的出芽长度增长了18%，如果在此基础上将氧浓度从20%降低到1%，血管生成的出芽长度增长了52%。说明CD34细胞和低氧情况都会促进内皮细胞血管生成的发生。

Paracrine effects of CD34 progenitor cells on angiogenic endothelial sprouting

R. J. Scheubel, J. Holtz, I. Friedrich, J. Borgermann, S. Kahrstedt, A. Navarrete-Santos, R. E. Silber and A. Simm

International Journal of Cardiology, 2008, 10.1016/j.ijcard.2008.10.009

实验材料：

1. CD34细胞
2. HUVEC细胞团         1000个细胞/团
3. Collagen Gel
4. ECGM                内皮细胞生长培养基
5. 共培养载玻片（图一）          德国ibidi公司，81806

图一：ibidi共培养载玻片特点，可见载玻片上有2个大孔，可以做两组平行实验。其中每个大孔中有9个小孔。可以分别铺不同的细胞，细胞互相分开而生长在同一个培养环境中。

实验设计

1）将共培养载玻片上其中一个大孔中的9个小孔分为三列：最左边一列铺入 7×104 的CD34祖细胞，中间和右边两列均按照每孔7个HUVEC细胞团与collagen gel相混铺入每个孔中（图二）。

图二：实验设计图示。设计成三列可以对比不同浓度梯度下由CD34细胞旁分泌的细胞因子对细胞团血管生成的影响。

1. 对照组为第一列不加入任何细胞，但仍使用collagen gel作为细胞基质在剩下两孔中加入HUVEC细胞团。
2. 低氧测试，将铺好细胞的培养板再分为两组，一组放入20%氧含量环境中37℃孵育30分钟，另一组放入1%氧含量环境中37℃孵育30分钟。
3. 在每个大孔中加入500μl内皮细胞培养基（ECGM），并继续在相应的环境中培养24小时。
4. 以10%多聚甲醛终止实验，并且每列至少选择10个细胞团进行血管生成出芽方向和长度的测量和数据统计。

实验结果

1. 细胞团血管生成形态对比（图三）：

图三： 有CD34祖细胞存在的内皮细胞团的血管生成出芽具有方向性，而空白对照出芽没有方向性。

2.出芽长度对比（图四）：

图四：a）无CD34的存在时，低氧环境使得血管生成出芽长度有显著的提升。B）在同样浓度下，CD34祖细胞也会使内皮细胞团的出芽长度有显著的提升。

3.20%氧浓度下，与CD34细胞共培养的细胞团血管生成出芽方向结果（图五）：

图五：在有CD34祖细胞的存在下，离CD34细胞近的细胞团血管生成出芽展现出一个方向特异性。

4）1%氧浓度下，与CD34细胞共培养的细胞团血管生成出芽方向结果（图六）

图六：在低氧的环境中，内皮细胞团对CD34祖细胞同样有方向敏感性，离CD34细胞近的细胞团血管生成出芽展现出一个方向特异性。