应用FLIPR 钾离子通道检测试剂盒对hERG通道阻断剂特性的分析

 

药物诱导的hERG (human ether-a go-go-related gene) 离子通道被阻断可能导致严重的致死性室性心律失常——尖端扭转型室性心动过速（torsade de pointes, TdP）。近年来，一批FDA 已批准药物由于其对hERG 的脱靶效应而被迫从市场上撤出。由此，愈发凸显了在药物研发早期阶段开展候选药物hERG 安全性筛选的重要性和快速增长的需求。本文重点阐述了一种新型钾离子通道检测试剂盒在FLIPRTETRA 高通量实时荧光成像分析系统上对hERG 阳性化合物的效应进行了评估和检测。实验根据钾离子(K+)通道对铊离子(Tl+)的通透性，采用了对铊离子敏感的荧光染料作为指示剂。实验对几种常见的hERG 阳性抑制剂的药理效应进行了检测，结果与IonWorks Barracuda® Plus 全自动膜片钳系统得到的数值作比较。

 

FLIPR 钾离子通道检测试剂盒（图1）含有铊离子敏感的指示染料。在开始染料加载步骤中，含有乙酰氧基甲（AM）酯的铊离子指示染料通过被动扩散方式穿过细胞膜进入细胞内部。细胞质酯酶剪切掉乙酰氧基甲（AM）酯并释放出其激活的荧光形态。另外，在细胞外采用了专利的屏蔽染料技术从而降低了背景荧光信号的干扰。可通过向细胞溶液中加入混合的K⁺和Tl⁺或包含了Tl⁺的配体来激活钾离子通道。荧光信号的增强表明了铊离子特异性地通过钾通道进入细胞内，从而对钾通道活性进行了功能性检测。

 

 

FLIPR 钾离子通道检测试剂盒(Molecular Devices cat. #R8222) 含有Tl⁺敏感染料、屏蔽染料、200 mM K₂SO₄、50 mM Tl₂SO₄、5X 不含氯离子的缓冲液以及HBSS + 20 mM HEPES 缓冲溶液。每个包装的试剂盒可以完成10 块96，384，或1536 孔板。实验检测流程见图2。

 

 

 

疏水性化合物由于非特异性结合到化合物板等实验耗材中，会影响到其显著的效能值。在本实验中，化合物首先在100%DMSO 中被稀释，然后在实验前立即转移到含HBSS+ 20 mM HEPES 缓冲溶液的玻璃衬里的多孔板中。

 

细胞稳定转染了人Kv11.1（hERG）离子通道的中国仓鼠卵巢（CHO）由ChanTest 公司（Cleveland, OH）提供。实验开始2 天前在黑壁底透的384 孔板中按照每孔6500 个细胞的密度种植细胞，培养基中包含了筛选抗生素并在37℃和 5% CO₂ 条件下培养。实验前24 小时生长培养基更换为含四环素的诱导培养基。实验前4 小时细胞从37℃转移至 28℃条件下培养以增加hERG 通道的表达。然后细胞板加入染料在室温下避光孵育一小时。

 

为进行药理学特性分析，先加入hERG通道阻断剂并在室温下孵育30 分钟。FLIPR^Tetra 系统在实验检测过程中向每个孔中加入之前优化好的缓冲液。系统采用了470-495nm 的LED 激发光源和515-575nm 的发射滤片。为进行对比，使用FluxOR 试剂盒（Life Technologies）进行了平行实验。依照生产厂家提供的方案进行操作。数据采样间隔为1 秒并持续140 秒。结果导出到GraphPad Prism 软件进行分析。

 

实验方案开发中首先取决于刺激hERG通道所需铊离子和钾离子浓度的优化。多孔板中放置多种浓度的K₂SO₄ 和Tl₂SO₄ 缓冲液。Tl⁺ 和 K⁺缓冲液用1倍浓度的不含氯离子的缓冲溶液稀释。由于每摩尔硫酸铊和硫酸钾含有2 份的阳离子，因而被看作为两倍的浓度进行处理。FLIPR^Tetra 系统在实验检测过程中向每个孔中加入刺激缓冲液。不同浓度诱发的信号曲线进行比较以确定最大信号对应的最优浓度值。结果显示，产生最大hERG 信号的最优Tl⁺ 和 K⁺浓度分别是1mM 和10mM（图3）。

 

 

 

为便于结果比较，所有同样的hERG 通道阻断剂均在IonWorks Barracuda1 全自动膜片钳系统进行了检测得到相应的IC₅₀ 值（图4）。为观察化合物的频率依赖性效应，电压刺激命令均以0.1Hz 频率在加样前后分别刺激5 次。第五个电流信号记录的sweep 中hERG 尾电流峰值被用来测定化合物效应。

 

 

 

应用FLIPR钾通道检测试剂盒对七个已知的hERG 阻断剂的效应进行评估。量效反应曲线见图5。IC₅₀ 值与IonWorks Barracuda 全自动膜片钳系统检测的IC₅₀的比较见表1 两者具有很好的相关性。

 

 

另外，其中3 个化合物被用于评估比较另一种基于铊离子的试剂盒——FluxOR 钾离子通道试剂盒（图6）。两者所得到的IC₅₀ 值很接近，具体见表2。然而，FLIPR 钾离子通道检测试剂盒的信号窗口是的2.25（基于信号与基线的比例），这一数值显著高于FluxOR（信号窗口是0.5）。表明了FLIPR 钾离子通道检测试剂盒的实验结果更精确、更可靠。阴性对照是4μM 特非那定对hERG通道的阻断效应，阳性对照是刺激性缓冲液对hERG 通道的效应。更低的空间差异和更大的信号窗口产生了更大的Z因子值，见图7。这可能源于FLIPR 钾离子通道检测试剂盒是真正的均相实验体系且是免洗的或无需更换培养基，从而显著减小了孔间差异性。

 

 

 

 

 

FLIPR钾离子通道检测试剂盒 采用均相 免洗 的实验方案检测钾离子通道功能活性。 在本文中，我们应用 了 hERG通道阳性抑制剂验证了 FLIPR钾离子通道检测试剂盒和电生理方法得到的结果是高度相关。

 

在另个单独运行的实验中， 相比于其它同类型试剂盒来说， FLIPR钾离子通道检测试剂盒 表现出了显著性更高的 信号窗口以及Z因子值。 明显提升的实验 结果表现 ，结合 FLIPR^Tetra系统的高通量性能，在 药物研发早期阶段将为究者提供一种强大的 hERG风险评估分析平台。