贴壁CHOMito-Photina®/H3发光蛋白细胞在FLIPRTETRA系统中的化学发光细胞实验

 

对于药物研发早期先导化合物寻找和确认，配有发光蛋白检测应用的FLIPRTETR是简便且可信赖的高通量筛选系统。发光蛋白检测部件包含了增强型CCD (ICCD) 相机和悬浮细胞系统。ICCD相机的增益可调节功能使得FLIPR^TETRA系统既可以适应基于染料的明亮的荧光实验，也可以记录信号强度较弱的化学发光蛋白实验。本篇应用文章描述了贴壁CHO Mito-Photina®/H3发光蛋白细胞在FLIPRTETRA系统中的实验结果和表现。

 

CHO mito-Photina/H3是由Axxam SPA (Milan, Italy)提供的细胞系，表达了线粒体靶点去辅基发光蛋白和 G蛋白偶联受体组胺3 (H3)，连同了Gαq蛋白。与腔肠素孵育时，Apo- Photina在细胞中表达形成了一个激活的Photina 分子，其在结合GPCR被激活引起的细胞内钙离子流后可以发射出蓝色光。 化学发光检测型 ICCD 相机可轻易地检测出Photina细胞发出的高相关光单位 (RLU)信号，无需相机饱和。使用相机的增益可调节功能使得FLIPR^TETRA系统同样可以检测很低的光信号并且在化学发光实验中所需细胞数量较少，减少了细胞培养方面的需求。

 

培养基：Dulbecco’s MEM/ 营养素混合F-12并添加了HEPES (Cat. #11039-047), 1.35 mM 丙酮酸钠 (Cat. #11360- 070), 10% FBS (Cat. #10082-147), 1%青霉素/链霉素(Cat. #15070-063)。500 μg/mL遗传霉素(Cat.#10131-027)。1% L-谷胱甘肽 (Cat. #25030-081), 均来自Invitrogen公司。

Versene (Invitrogen Cat. #15040-066)

不含钙镁离子的PBS (Invitrogen Cat. #14190 或类似溶液)

 0.05% 含EDTA的Trypsin (Invitrogen Cat.#25300-054)

天然的腔肠素（细胞提供者建议）

BSA Media: DMEM/F12 （不含酚红），含15 mM HEPES (Invitrogen Cat.#11039-021)，0.1% BSA (Fraction V heat shocked, low endotoxin, low protease (Sigma Cat. #A6003 或类似物)  Water for injection (Irvine Scientific Cat.#9309 or equivalent)

 Tyrode Buffer (pH7.4)—alternate for BSA Media (all chemicals from Sigma): 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM

384-well 黑壁底透记录板（Corning Cat. #3172 or equivalent)

 

发光蛋白的化学发光实验中涉及到细胞、化合物和仪器的准备。仪器设置在表1、2、3中有相应的描述。更多的信息可以参照FLIPR_TETRA系统使用说明书中化学发光实验方案的7.13章节。

 

第一步：实验前，复苏细胞并在筛选抗生素条件下培养，遵照细胞提供者的指导方案操作。

第二步：开始实验前的一天用trypsin从flask中消化细胞

第三步：在无抗生素的培养基中，按照每孔2500-10000个细胞在384孔黑壁底透的记录板上种上细胞。37°C 和5% CO₂过夜培养。

第四步：实验当天上午，去除记录板孔中的培养基。

第五步：在光照强度弱的环境中，每孔中加入25 μL BSA培养基或含有5 μM 天然腔肠素的替代培养基。

第六步：盖上板盖，然后包上锡箔纸以避光，然后在22℃或更低温度孵育4-6小时以优化腔肠素反应。

 

化合物板能包含足够的体积满足3-4个记录板的需求。准备384孔的聚丙烯化合物板并预留足够的体积避免向细胞板移液时产生气泡。

 

 

 

 

 

 

第一步：加载384孔黑色FLIPRTETRA系统枪头

第二步：在ScreenWorks®软件中创建一个FLIPRTETRA系统实验方案。 相机和记录参数设置见表1。移液和加样参数见表2和3。在本次实验中未使用悬浮细胞装置。移液加样过程中的维持和排空体积设置可能会产生气泡，引起信号误差。更新软件设置之前保存文件。

第三步：确保腔肠素加入至细胞板并避光。选择下列合适的方法来完成您的实验。

这里列出了三种不同过程的实验方案：

 

第四步： 加入25 μL 2X 激动剂至细胞板中，然后记录数据30-60秒。

 

或者

第四步： 加入25 μL 2X 抑制剂至细胞板并记录数据。

第五步： 避光孵育细胞板15-30分钟。

第六步： 加入25 μL 3X 激动剂至细胞板并记录数据

 

或者

第四步： 实验前先加入抑制剂至细胞板并孵育是可接受的。

第五步： 避光孵育细胞板15-30分钟。

第六步：加入25 µL 3X 激动剂至细胞板并记录数据。

 

图1所示的RLU 信号的数据简化是在ScreenWorks软件中根据信号的反应/背景进行计算的。图2所示的RLU 信号简化是在ScreenWorks软件中根据信号的最大值—最小值进行计算的。量效曲线是采用GraphPad Prism® 3软件进行计算的。

 

在本次实验中，采用细胞数梯度减少来决定实验的检测范围。细胞在37°C和5%CO₂条件下过夜培养使其在实验前充分贴壁。配有化学发光检测部件的FLIPRTETRA 系统在记录时添加激动剂至贴壁细胞。RLU值既可以用于最大值减去最小值的计算也可以用于效应相对于背景信号的计算。根据实验中每孔1250个细胞计算的EC₅₀值与每孔10000个细胞的结果是类似的。图1显示了随着细胞数量增加信号窗口的增加。在每孔2500个细胞时，信号窗口大约是300:1，与之相比较FLIPR® Calcium 4 Assay Kit荧光信号窗口大约是4：1（数据未列出）。之后的贴壁细胞实验采用每孔2500个细胞来完成，过夜种板培养。贴壁细胞Photina 实验可以在中低细胞密度下完成，并且在EC₈₀ 筛选浓度下得到很好的Z值。图1所示信号效应是按照反应/背景来计算的。

 

在图2 所示的实验中，在优化好的细胞浓度条件下比较了激动剂效应和抑制剂效应。384 孔黑壁底透的细胞板每孔中种下2500 个CHO mito-Photina/H3 细胞并在37°C 和5% CO₂ 下过夜培养。培养基去除后，在实验缓冲液中加入5 μM 天然腔肠素并避光孵育四小时。

 

在本实验中，数据简化结果是按照记录阶段最大值减去最小值来计算的。激动剂的EC₅₀ 和抑制剂IC₅₀ 值与文献报道的数值是一致的。

 

 

 

 

 

 

配有化学发光检测部件的FLIPR^TETRA 系统表现出更卓越的信号检测能力。不仅表现在一个相机可以检测荧光和化学发光，而且相机的增益可调节，从而在化学发光检测时可达到无与伦比的动态范围。在进行化学发光高通量筛选实验中系统是被证明很有用途的。在配有化学发光检测部件的FLIPR^TETRA 系统中基于发光蛋白的钙流实验具有以下优点：

 

Ø 系统无与伦比的动态范围可以检测从极亮至昏暗的所有光信号。

Ø 更低的背景噪音，更高的信噪比和更大信号窗口

Ø 更低的细胞数量，减少细胞培养工作量

Ø 实验更灵活，贴壁细胞或悬浮细胞均可进行实验

Ø 可超过6 小时的长时间持续实验

Ø 无论是激活还是抑制实验均可以得到与文献报道高度一致性的数据结果

Ø 消除了化合物自发荧光对结果的干扰

Ø 更低的试剂耗费

 

S. Bovolenta, M. Foti, Lohmer, S., S. Corazza. Development of a Ca2+-Activated Photoprotein, Photina, and Its Application to High-Throughput Screening. J Biomol Screen 2007; Vol. 12(5) 694–704.