Real-time PCR 数据导出 —— ABI仪器篇

1.      Real-time PCR数据：Real-time PCR完成后，所有数据并非可以直接导出，由于每一次实验的情况都不相同，仪器的很多默认设定都会对最终数据结果造成重大偏差，所以在完成PCR过程后，需要人为对实验结果进行条件设置，才能提取到科学有效的实验结果，进而完成对实验结果的分析和判断。

 

2.      数据导出调整步骤：a调整参比荧光选项；b调整基线；c调整阈值

 

3.      概念：

 

a.参比荧光（dye as the passive reference）：参比荧光的作用是用来消除光程差，调整扩增曲线线形和溶解曲线峰形，与PCR反应所加荧光染料mix相关，不同公司品牌的mix所含参比荧光的种类不一样，如：Takara选用ROX，ABI则没有参比荧光，数据提取时，需注意下参比荧光选项，如选错，扩增曲线或溶解曲线或将无法正确呈现。

 

b.基线（Baseline）：是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直线，这样的直线即是基线。基线调整包括基线起点与基线重点，起点一般设在2-3个CT，终点设在扩增曲线开始上扬即进入指数增长期的CT值前2-3个CT，终点设置太靠前会降低CT值，太靠后则会增加CT值。如仪器默认基线期与上述基准不一致，很可能需要人为设定调整。

 

c.荧光域值（threshold）：一般仪器会将PCR 反应前15个循环（即基线期）的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值默认是PCR 3-15个循环荧光信号标准差的10倍，正确的荧光域值应设定在PCR扩增的指数期循环数。

 

4.      StepOne参比荧光: 在plate setup中选择和设置参比荧光

5. StepOne基线（Baseline）：选中Analysis Setting按钮，出现如下对话框

•    选中Advanced Setting选项，将每个差别大Baseline End值调到正确数值。

•    最后点击Apply Analysis Setting按钮

•    左图调整前基线微上翘，有图调整后基线平整

 

•    6. StepOne阈值（Threshold）：选中孔板中所有的数值，如下界面选择log、Target对话框

•    将每个基因的Tredshold Auto勾选掉，阈值数值调整范围原则在指数增长期。

阈值数值调整范围原则在指数增长期，该范围中，曲线斜率相同，ΔCT值不变

 

•    注意同一板结果所有内参目的基因阈值设定需一致，这样的ΔCT有可比性。