新式高分辨率流式技术解构内皮细胞微粒与冠状动脉疾病的关系

新式高分辨率流式技术解构
内皮细胞微粒与冠状动脉疾病的关系

关键词：循环微粒（circulating microparticle, cMP），冠状动脉疾病（Coronary Artery Disease,  CAD），循环微粒检测

什么是循环微粒﹖

循环微粒（circulating microparticle, cMP）是细胞激活、损伤或凋亡后从细胞膜脱落的小囊泡。cMP的直径约为0.1μm - 1μm，膜表面暴露着带负电的磷脂酰丝氨酸（posphatidylserine, PS）以及细胞来源特异的膜表面抗原。这些特征将循环微粒区别于凋亡小体（apoptotic body）和外来体（exosome）， 凋亡小体是细胞凋亡时以出芽方式形成的，直径大于1μm；而外来体来源于细胞内的多泡小体（multivesicular bodies），以外分泌的形式释放出来，直径大小为30nm - 100nm 。

根据微粒的来源，可以将微粒分为血小板微粒（platelet microparticles, PMPs）、红细胞微粒（erythrocyte microparticles, Ery-MPs）、内皮细胞微粒（endothelial cell microparticles, EMPs）、粒细胞微粒（granulocyte microparticles, GMPs）及淋巴细胞微粒（lymphocyte-derived microparticles,  LMPs）等。研究证实，在健康人群中，PMPs在循环血液中所占的比例最大，其次是Ery-MPs。以往认为微粒只是单纯的无活性的细胞碎片，但越来越多研究表明cMP在生理和病理情况下充当着重要的角色，尤其在抗凝、促炎、内皮损伤、血管收缩、诱导血管生长以及免疫调节等方面起重要作用，在糖尿病、心血管疾病、艾滋病、慢性炎症疾病以及癌症中都发现循环微粒水平的升高，对于它的认 识还在不断地探索，其研究也越来越多。

循环微粒在冠状动脉疾病中的研究

冠状动脉疾病（Coronary Artery Disease, CAD）是心脏疾病的主要类型，也是导致心脏病发作的主要原因，它是由于粥样斑块在动脉内壁上的累积，导致动脉管腔变小，血流减少。CAD的发展非常缓慢，大多数病人可能几十年都没有明显的症状，直到有一天突然心脏病发作。因此，对CAD的早期诊断可以大大降低病人心脏病发作的风险，传统的诊断方法包括心电图、量血压、血管造影等，但这些方法都只能在比较晚期的时候起作用。研究发现，血管内皮细胞机能障碍是CAD发展过程中的一个重要因素，而内皮细胞微粒（EMPs）是判断内皮细胞功能的一个新的生物标记物。实际上，许多研

循环微粒的检测方法

目前cMP的检测方法主要有激光共聚焦显微镜、扫描和透射电子显微镜、原子力显微镜、流式细胞仪和ELISA等，由于通量高、操作简单，ELISA和流式细胞仪是比较常用的方法。ELISA方法容易受其他可溶性抗原的干扰，而且无法知道微粒的大小、数量等信息。流式细胞仪提供了更有效、快捷的微粒分析能力，现已有多种流式细胞标记物可用于微粒检测，它们主要用于检测微粒的活化状态及其细胞来源。但传统流式细胞仪的检测极限通常是0.5μm，由于无法与背景噪音区分，直径小于0.3μm-0.5μm的微粒难以检测。

新式高分辨率流式细胞仪在检测循环微粒的优势

英国Apogee公司的A50高分辨率流式细胞仪突破传统流式细胞仪的检测极限，优化的光学模块和优异的散射光检测能力使得A50具有检测小颗粒的最高灵敏度（100nm）和最好的光散射分辨率（10nm）。Fig.2展示的是Apogee与传统流式细胞仪的技术对比，可以看到FC500和LSRII只能勉强区分0.5μm和0.6μm的微珠，0.5μm以下的微珠完全无法区分，而Apogee可以轻松地将0.2μm的微珠和0.4μm的微珠分成两个群。由于检测能力的限制，FC500和LSRII只能检测到部分的0.2μm和0.4μm的微珠，对于0.2μm的微珠，LSRII和FC500的丢失率分别达到79%和96%；对于0.4μm的微珠，丢失率也分别达到12%和56% [2]。相反的，利用Apogee A50突出的高灵敏度和分辨率，可以清晰的将直径相差10nm以上的微粒样本进行分群、计数、分析。另外，多达9通道荧光检测器，可以灵活使用cMP特定

粒的流式细胞仪，在循环微粒的检测上优于传统流式细胞仪。

Fig. 2. Size resolvability of different flow cytometers using polystyrene microspheres. Graphs show forward scatter relative intensity for 0.2 - 0.8μm polystyrene microspheres for three flow cytometers.

Apogee A50的应用展望

[1] Hu S-S, Zhang H-G, Zhang Q-J, Xiu R-J (2014) Small-Size Circulating Endothelial Microparticles in Coronary Artery Disease. PLoS ONE 9(8): e104528.
[2]Chandler WL, Yeung W, Tait JF. A new microparticle size calibration standard for use in measuring smaller microparticles using a new flow cytometer. J Thromb Haemost 2011; 9: 1216–24.