小鼠Treg检测操作步骤

1、在每个流式上样管中加入100 µl准备好的细胞悬液，细胞数约为1x106个.

2、按照细胞表面抗原染色方法标记表面抗原。根据说明书加入CD4和CD25抗体100 µl体系中使用0.125 µg FITC anti-mouse CD4，0.06 µg APC anti-mouse CD25抗体。最好根据这些试剂详细的说明书操作。4 ℃孵育30 分钟。孵育表面抗体之前加入Fc受体阻断剂。 

3、用预冷流式染色缓冲溶液洗涤细胞（离心并转移）。

4、旋涡震荡重悬细胞后加入1ml的固定/破膜工作液（Fixation/Permeabilization）（1:3稀释好），并再次旋涡混匀。

5、避光4℃孵育30分钟到18小时（孵育30分钟到18小时，结果一样）。

6、加入2ml 破膜缓冲液（Permeabilization Buffer）（1:9去离子水稀释）离心洗涤细胞并弃去上清液。

7、重复第6步操作洗涤细胞。

8、（可选）加入含0.5 µg Fc受体阻断剂的破膜缓冲液，保证100 µl体系4 ℃孵育15分钟。

9、封闭液无需洗去，体系加入0.5 µg PE anti­mouse/rat Foxp3抗体和PE Rat lgG2a同型对照（用Permeabilization Buffer工作液进行稀释），避光4℃孵育至少30分钟。建议进行预实验摸索出抗体的最适浓度。

10、加入2ml破膜工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。

11、重复上一步洗涤细胞。

用适量体积的Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞，并上机检测并分析。注：由于染色过程中使用了细胞固定和破膜，对比起活细胞在形态上会有一定变化，因此FSC/SSC图中圈门时需要做一定调整。 

以上步骤仅供参考，以厂家说明书为准。