TRIzol法同时提取RNA、DNA、蛋白质

     TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol试剂有多组分分离作用，与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质.TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。

RNA的提取

准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS（溶液均需用DEPC处理过的水配制）。

操作步骤：

1. 匀浆处理：

a.组织将组织在液氮中磨碎，每50～100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞　直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm²面积（即3.5cm直径的培养板）加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c.细胞悬液离心收集细胞，每5～10×10⁶动物、植物、酵母细胞或1×10⁷细菌细胞加入1mlTRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

2.将匀浆样品在室温（15～30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。(我们是5分钟)

4. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色（我们见到的是红色）有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

5. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTRIzol加入0.5ml异丙醇（加入移出液相等体积），室温放置10分钟。

6. 2～8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

8. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2～8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。

9.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5～10分钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25～200μl无RNase的水或0.5℅SDS，用枪头吸打几次，55～60℃放置10分钟使RNA溶解。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。

预防RNase污染注意事项：

1.经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。

2.使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。

3.RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。

4.配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01℅v/v，放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作）。

注意事项：

1.从少量样品（1～10mg组织或102～104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800mlTRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5～10μgRNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。

2.匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2～8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。

3.分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30～60分钟。

预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：

肝和脾6～10μg ，肾3～4μg ，骨骼肌和脑组织1～1.5μg ，胎盘1～4μg ，上皮细胞8～15μg ，成纤维细胞5～7μg 。

常见问题分析：

得率低：

A.样品裂解或匀浆处理不彻底。

B.RNA沉淀未完全溶解。

A260/A280<1.65 ：

A.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高。

B.样品匀浆时加的试剂量太少。

C.匀浆样品时未在室温放置5分钟。

D.吸取水相时混入了有机相。

E.RNA沉淀未完全溶解。

RNA降解：

A.组织取出后没有马上处理或冷冻。

B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃。

C.细胞在用胰酶处理时过度。

D.溶液或离心管未经RNase去除处理。

E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5 。

DNA污染：

A. 样品匀浆时加的试剂量太少。

B.样品中含有有机溶剂（如乙醇，DMSO等），强缓冲液或碱性溶液。

蛋白聚糖和多糖污染：

沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中，每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液（0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCl）混合离心，按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。

 

DNA的分离

准备试剂：乙醇0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）、 75%乙醇、8mM NaOH

操作步骤：

1. 样品加氯仿分层后，移去上层水相，用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1mlTRIzol加0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3分钟，2～8℃不超过2000×g离心5分钟。

2. 移去上清，（如需分离蛋白质，可保留，进一步操作见后）用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用1mlTRIzol加入1ml柠檬酸钠，室温放置30分钟，2～8℃2000×g离心5分钟，弃上清，重复一次。可以再重复一次。

3. 用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每用1ml TRIzol加入1.5～2 ml75%乙醇，室温放置10～20分钟（不时颠倒混合）2～8℃2000×g离心5分钟， 弃上清。

4. 室温放置晾干DNA 5～15分钟，用8mM NaOH溶解DNA。从50～70mg组织或107细胞中分离的DNA溶于300～600μl 8mM NaOH，DNA的浓度通常为0.2～0.3μg/μl。提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris缓冲液中，建议用弱碱溶解，8mMNaOH的pH值为9，溶解DNA后可用TE，HEPES调节pH。从某些样品（尤其是组织）中提取的DNA中可能包含一些胶状不溶物可>12000×g离心10分钟除去。

DNA的定量：取一份溶于8mMNaOH的DNA加水测A260值。一单位A260值相当于50μg/ml双链DNA。根据DNA产量可估计细胞数，人、大鼠、小鼠、1×106二倍体细胞含DNA的量分别为7.1μg，6.5μg，5.8μg。

预期产量：1mg组织或1×106细胞提取DNA分别为肝和肾3～4μg 骨骼肌，脑组织，胎盘2～3μg 人，大鼠，小鼠培养细胞（1×106）5～7μg 成纤维细胞5～7μg。

应用：

1.用于PCR 溶于8mM NaOH的DNA用0.1M HEPES调pH至8.4，取0.1～1μg DNA用作模板。

2.酶切反应用HEPES或1mM EDTA调节pH至适当值。每μg DNA使用3～5单位的酶，80～90%的DNA是可消化的。

1ml 8mM NaOH溶解的DNA样品pH值调节

Final pH  0.1M HEPES（μl） Final pH   1M HEPES（μl）

8.4       86                 7.2         23

8.2       93                 7.0         32

8.0      101

7.8      117

7.5      159

注意事项：

1. DNA在中间层和有机相中时可在2～8℃保存过夜。

2.DNA沉淀在75%乙醇中2～8℃可保存几个月。

3.DNA在8mM NaOH溶液中4℃可放置过夜，如长期保存需用HEPES调节pH至7～8并且加EDTA至1mM，可置于4℃或-20℃长期保存。

常见问题分析：

得率低：

A.样品匀浆和裂解的不彻底。

B.最终得到的DNA沉淀没有完全溶解。

A260/A280<1.70 ：

A. 检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。

B.酚除去的不彻底，可用0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）再洗一遍DNA沉淀。

DNA降解：

A.组织取出后没有马上处理或冷冻。

B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃。

C.样品匀浆时使用了高速匀浆仪。

RNA污染：

A.氯仿分层后水相去除的不干净。

B.DNA沉淀用0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）洗的不彻底。

蛋白质的提取

准备试剂：异丙醇、含0.3M盐酸胍的95%乙醇、无水乙醇、1%SDS。

操作步骤：

1.取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml TRIzol加1.5ml异丙醇，室温放置10分钟，2～8℃12000×g离心10分钟弃上清。

2.用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1mlTRIzol加2ml洗涤液，室温放置20分钟，2～8℃7500×g离心5分钟，弃上清，重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。

3.真空抽干蛋白质沉淀5～10分钟，用1%SDS溶解蛋白质，反复吸打，50℃温浴使其完全溶解，不溶物2～8℃10000×g离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于Western Blot或-5至-20℃保存备用。

注意事项：

1.蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中2～8℃一个月以上或-5至-20℃一年以上。

2.用0.1% SDS在2～8℃透析三次，10000×g离心10分钟取上清即可用于Western Blot。

常见问题分析：

得率低：

A.样品裂解或匀浆处理不彻底。

B.最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解。

蛋白质降解：组织取出后没有马上处理或冷冻。

电泳时条带变形：蛋白质沉淀洗涤不充分。

操作步骤：

1．      用Trizol试剂匀浆细胞和组织的方法同RNA提取步骤。

2．      在细胞匀浆中加入氯仿，每1ml Trizol的起始用量加入0.2ml氯仿。剧烈震荡30秒钟后室温放置2~3分钟。

3．      4℃下10,000g离心10分钟。

4．      小心吸取并丢弃上层水相（该水相中富含细胞总RNA，如果需要提取RNA，则收集该水相）。

5．      在剩下的中间层及有机相中加入无水乙醇，每1ml 起始Trizol用量加入0.3ml无水乙醇。颠倒充分混匀后室温放置2~3分钟。

6．      4℃下2,000g离心5分钟。

7．      小心吸取并收集上层的酚醇有机相（沉淀为DNA），转移到一个新的离心管中，加入异丙醇，每1ml 起始Trizol用量加入1.5ml异丙醇。轻轻混匀后室温放置10分钟。

8．      4℃下12,000g离心10分钟。

9．      丢弃上层液相，沉淀即为蛋白质。用清洗液（盐酸胍溶于95%乙醇中，终浓度为0.3M）清洗沉淀3次。每1ml 起始Trizol用量加入2ml清洗液清洗。在每次清洗过程中，先将沉淀保留于清洗液中20分钟（室温下），然后在4℃下7,500g离心5分钟。最后一次清洗后，丢弃上层液相，将沉淀悬浮于2ml乙醇中，涡旋震荡15秒后在室温下放置20分钟，然后在4℃下7,500g离心5分钟。

10.  丢弃上层液相，将沉淀真空干燥5~10分钟。然后将沉淀溶解于1% SDS（十二烷基硫酸钠）中。可于50℃水浴中用tip头反复吹打以助溶。不溶物在4℃下10,000g离心10分钟去除。收集上清，转移到新的收集管中。该上清中的蛋白样品可直接用于Western Blotting实验或保存于-20℃。

²        附注：

1.         蛋白沉淀保存于清洗液（盐酸胍溶于95%乙醇中，终浓度为0.3M）中，或保存于乙醇中，在4℃下可保存至少一个月，在-20℃下可至少保存一年。

2.         在上述步骤7中收集的酚醇有机相，可用0.1% SDS透析三次，透析后4℃下10,000g离心10分钟。上清液可直接用于Western Blotting实验。如果采用这种实验方案，可提高蛋白的回收效率。

3.         如果蛋白溶液中的SDS浓度高于0.1%，则不宜采用考马斯亮兰染色法（Bradford）法对蛋白定量。因为蛋白溶液中可能含有痕量酚，也不宜采用紫外分光光度法定量蛋白质。采用上述方法提取的蛋白，可以用lowry法或BCA法进行蛋白定量。