Agrisera公司抗体常见问题问答

1. 问：多克隆抗体的优势是什么?
答：多克隆抗体能够同时识别具有多种不同表位的抗原，具有能够容忍抗原微小的改变如聚合或轻微的变性。检测变性蛋白质多克隆抗体是理想的选择。

2. 问：血清中的多克隆抗体的具体浓度是多少?
答：最常见的是，血清中特异性抗体浓度变化是0.05-0.2 mg/ml (基于Agrisera通过数以百次亲和纯化的内部评估)。在特殊情况下，较好的多克隆血清能包含特异性抗体1- 3 mg/ml的血清(甚至更多)。

3. 问：单克隆抗体的优势是什么?
答：单克隆抗体仅能识别一种抗原表位，这在某些情况下可能是个缺点，如免疫沉淀反应和用于免疫亲和柱时。单克隆抗体作为一抗用于检测组织中抗原是非常好的。理论上与多克隆抗体相比他们应该具有更低的背景，但并不总是这样。单克隆抗体具有较高的同质性， 结果具有高度可重复性 (如果其他实验条件可以保持不变)。

4. 问：当选择一个肽用于免疫原，什么是重要的?
答：通常蛋白的C 端或N端是蛋白质中暴露机会最高的部分。另外，为了模仿蛋白的行为，合成的肽应该有类似于蛋白质"cut out off"后的结构和电荷。
因此：
----来源于C端的多肽那么N端应用乙酰化修饰
----来源于N端的多肽那么C端应用酰胺化修饰
----来源于内部序列的多肽则需要肽的两端都修饰
下面的几点因素也在考虑范围内：
----你感兴趣的蛋白家族里是否有其他的蛋白质，应该避免交叉反应的发生。
----蛋白的结晶结构（或同源蛋白）已知吗？这将有利于研究肽的科学家找到最好的用于抗体生产的肽。
----生产的抗体的最终应用？天然的或变性的技术？

5. 问：什么样的抗原(s)可以用于注射?
答：天然蛋白，重组蛋白，多肽碳水化合物或其他微生物、细菌、病毒提取物可用于免疫接种，需要大小为5 - 10 kDa的小分子诱导充分的免疫反应，有生物毒害的材料禁止用于免疫接种。
重要提示：
----如果抗体作用于变性的靶标蛋白 (例如：免疫印迹、固定组织免疫组化)，变性的抗原是首选(如凝胶块， 包涵体蛋白质)。
----如果使用的抗体的目标蛋白质是天然蛋白(例如：免疫沉淀反应)，非变性的抗原是首选(蛋白质溶解在不含变性剂的溶液中)。
----并不是所有anti-peptide抗体都能识别天然蛋白质，因此谨慎选择肽序列是至关重要的。
----通过重组蛋白在细菌表达体系诱导所制备的抗体在某些情况下无法识别天然蛋白质。原因可能是在细菌细胞中表达的蛋白质抗原发生错误的折叠。
不能保证用于任何的免疫反应中都能得到很好的成功。
相关参考文献：
"Monoclonal antibodies： principles and practice" by James W. Goding， 1996， ISBN 0-12-287023-9;
Publisher： Academic Press. Using Antibodies： A Laboratory Manual， E.Harlow and D.Lane， 1999， ISBN： 0879695447;
Publisher： Cold Spring Harbor Laboratory Press. Hjelm et al. (2012). Parallel immunizations of rabbits using the same antigen yield antibodies with similar， but not identical， epitopes. PLOS ONE.

6. 问：用于免疫接种的抗原需要多少量?
答：这取决于抗原的免疫原性。在标准试验方案中(对于兔、山羊或母鸡)我们使用：大约500µg肽/动物/ 15周龄，约400µg蛋白质/动物/ 15周龄。？  
如果所选动物抗原和抗体之间的关联性较低，免疫接种时较少量的抗原(少于10µg)也是可以接受的。我们还可以使用自己的免疫方案。如果蛋白质需要浓缩，请注意，在某些情况下，在浓缩设备中蛋白会部分附着在膜上从而部分蛋白质损失。

7. 问：为什么抗原诱导反应只会产生一些IgM抗体?
答：由于缺乏T细胞刺激(Goding ，1993)，高度保守的哺乳动物蛋白质的响应往往很薄弱，主要导致IgM抗体的产生，不过，也有例外。如果是保守的哺乳动物抗原，则使用亲源关系远的物种如母鸡。

8. 问：用于免疫接种的抗原应如何制备?
答：抗原应溶解在缓冲溶液(Tris， MOPS， Hepes)。不溶性抗原(包涵体)和可溶性的一样好。理想的抗原浓度是1mg/ml，然而较低浓度也可以接受的。
您也可以把含有目标蛋白的 SDS-PAGE胶发给我们，将胶放于水中变脱色，因为醋酸能使得蛋白质进一步地变性。
避免：对动物有毒的添加剂，如蛋白酶抑制剂如PMSF、叠氮化钠等等。可接受：低量的SDS、咪唑、尿素、胍，非离子型去污剂，EDTA或EGTA和聚丙烯酰胺。添加的最终的量在很大程度上取决于样本体积/抗原浓度。请查询。

9. 问：选择哪个物种用于免疫接种?
答：使用IgG (兔、山羊)和IgY(鸡)抗体针对同一抗原的优势：
----独立确认预期的目标蛋白质被检测。
——抗体库具有不同的特性，在不同的技术中能起到互补的作用(免疫印迹、免疫沉淀反应等)双重染色。
----一般从遗传角度上选择与抗原有较远的亲源关系的物种用于免疫接种 (如母鸡非常适合生产保守序列的哺乳动物蛋白质)。找到更多关于IgY信息。

10. 问：在我开始实验前可以测试来源于一些动物的免疫前血清或卵黄吗?
答：按照您的要求，在您开始您的实验前Agrisera会送你几个免疫前血清或卵黄样品。您可以选择具有最低背景信号的动物用于测试。

11. 问：在兔子中生产的抗体比那些在鸡中生产的更好吗?
12. 答：生产抗体的过程是抗原，特异动物免疫反应和测试的结合。如哺乳动物的保守靶标蛋白，我们推荐使用在鸡中生产的抗体。
因为他们在进化上亲缘关系更远，且他们的免疫系统与保守的哺乳动物蛋白反应更好，而这些保守哺乳动物蛋白可能不会被山羊或兔子的免疫系统识别。

13. 问：我定制了一个抗体。我怎么知道定做的抗体能识别正确的蛋白质?
答：首先用间接的ELISA分析做确认，ELISA板上用动物免疫反应的蛋白质或多肽包被，把血清加入板中孵育，随后二抗发出信号。这是第一个证据能说明免疫动物产生的抗体能识别目标蛋白或肽。然而，这个结果可能与在自然组织中检测到的水平不直接对应。ELISA板上包被了很好的暴露的多肽或蛋白质，在只含有少数细胞的自然组织蛋白中可能不会发生。因此，测试包括收集已知或我们猜测能正确表达目标蛋白的材料。另外也包括以缺失或过表达突变体提取物为对照的测试。在免疫印迹中使用重组蛋白作为对照，可能会为我们提供一些信息，但在某些情况下， 产生的抗体只识别重组蛋白而不识别天然的蛋白质。另一个风险是，我们的膜暴露的时间太短，使得只能显示出重组蛋白的信号。考虑特定组织的表达水平，遵循一定的发展模式，有些蛋白质难以检测。为了测试的成功所有这些因素都必须考虑在内。
14. 问：如果我的抗体在免疫定位试验中成功了，是否该抗体在免疫印迹和其它的试验中也能用呢?
答：再次强调，它取决于抗体识别蛋白质的哪一部分和在固定后或免疫印迹后蛋白的哪一部分暴露了。如果多克隆抗体是合成肽，它能识别抗原池，如果这类抗原固定后没有暴露----抗体将不会识别抗原。在某些情况下在缓冲液中加入6 - 8 M尿素有助于蛋白质的暴露。   
15. 问： 可以获得多少血清或鸡蛋?
答：山羊：200毫升血清/月
兔子：50毫升血清/月
母鸡： 25个蛋/每月
16. 问：如何储存抗体？
答：血清中的抗体，对于抗体这是一个非常稳定的存储形式。在-20°C或-70°C的血清通常可以保存多年。在一些特殊的情况下， anti-peptide抗体储存的时间更短。短时间可以储存在4°C。在某些情况下操作要更加小心，第一步在-20°C冷冻，之后放于-70°C冷冻的效果更好。
总IgG片段（IgG蛋白经过蛋白G基质纯化后），一般抗体以这种形式是稳定的。他们能够储存在-20°C或-70°C达数年之久。对于短期使用时可加入叠氮化钠（终浓度为0.02 %）或其他防腐剂。
总IgY片段（IgY抗体从卵黄中提取和纯化的抗体），纯化的IgY片段在室温下时非常稳定的（尽管我们不推荐室温作为储藏条件）。IgY能够在含有0.02%的叠氮化钠（注意：叠氮化钠抑制HRP的活性）下或50 ug/ml硫酸庆大霉素的条件下储存在4°C。要避免IgY冻融或储存在干冰环境下，IgY能直接储存在-20°C。
参考文献："The IgY preparations were stable over time. No loss of antigen recognition was observed after storage for 3 years at + 4°C". F.De Ceunick et al. Journal of Immunological Methods 252 (2001) 153-161.
卵黄中的卵黄抗体需要在含0.02%叠氮化钠（注意：叠氮化钠抑制HRP的活性）或含50 ug/ml硫酸庆大霉素 的条件下储存于4°C。卵黄不要冷冻储藏，否则这会使得纯化抗体非常困难，经过6个月储存后纯化卵黄中的抗体将会变得更加的困难。

亲和纯化抗体：
最脆弱的抗体，应该小心考虑存储条件，实验上检查每一个抗体。针对不同抗原表位的亲和纯化抗体其稳定性不同。有些会在纯化后直接沉淀，活性仍然存在。对于一个给定的抗体很难提前预测储存条件-----有一些可选的方案用于测试：
-20°C或-80°C
- 4°C+叠氮化防腐剂(0.02%)或硫柳汞
-20°C+甘油;甘油终浓度10或50%
-20°C+BSA终浓度为0.05 -0.5%
 IgG

哺乳动物，多克隆抗体亲和纯化后沉淀，可能直接沉淀或冷藏过夜后沉淀。一些抗原能够刺激产生一类IgG，这被称为冷球蛋白，意味着他们将在冷条件下沉淀。然而，加热到室温可以解决这个问题。抗体溶解后可以通过离心去除沉淀。
IgY
鸡抗体也会在过夜冷冻储存后或几周后沉淀。加热到室温经常帮助那些沉淀溶解。否则，使用前IgY溶液需要先经过离心后去沉淀再使用。
抗体溶液无防腐剂储存，有着被细菌污染的风险，这通常是最常见的蛋白质失活的原因。

常规建议：
----对于较大体积的亲和纯化抗体，滤灭的抗体样本和分成等份的液体避免多次冻融。
----存储蛋白质的浓度在0.5 - 1 mg/ml。
----检查蛋白质在不同储存条件下的稳定性，尤其是IgM。
重要提示：
叠氮化钠将抑制辣根过氧化物酶的活性及干扰抑制一些耦合方法和生物测定。然而，在ELISA或WB实验中制备IgY(含0.02%叠氮化钠)作为一抗稀释到1：2000倍时，叠氮化钠的含量会因稀释而不影响实验。在抗体溶液中也可以选择其它试剂来防止细菌生长：
----0.01%硫柳汞
----50微克/毫升硫酸庆大霉素  

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