RNA酶污染的预防措施

RNA的的化学性质比DNA活跃得多。RNA分子上紧邻磷酸二脂键的2′羟基基团能直接被RNA酶利用来作为活性因子，从而使得RNases无需金属离子就能发挥活性。由于RNA酶在环境中广泛存在，特别是RNase A，结构极其稳定，不能通过高温高压灭菌失活，因而极难消除，对保持RNA样品的完整性构成极大的威胁。由于RNase A类酶依赖于活性位点处的组氨酸残基起催化作用，因此能被组氨酸烷化剂DEPC所抑制。为了避免RNA降解，RNA相关实验都严格应遵循下述操作规则：

 

1.使用RNase-free溶液；

 

2.佩戴清洁一次性手套并经常更换；

 

3.建立RNA工作专区，使用专用的移液器和RNase-free枪头；

 

4.使用无菌的一次性塑料器皿，尽量避免使用玻璃器皿；

 

5.金属工具可以用快速灼烧数秒钟的方式来快速消除污染；

 

6.玻璃器皿可在180℃以上温度下烘焙数小时，或用新鲜配制的0.1%(v/v) DEPC或无水乙醇浸泡一小时后，高压灭菌去除残余的DEPC；

 

7.电泳槽等含聚碳酸脂或聚苯乙烯材料的器皿应该在3%的过氧化氢中浸泡10分钟，然后用大量的RNase-free水冲洗干净后使用；

 

8.塑料制品可用新鲜配制的0.1% (v/v) 的DEPC水浸泡过夜，然后高温高压灭菌1小时水解残留的DEPC；

 

9.试剂处理：

1）每升溶液中加入1 ml的DEPC，室温振荡过夜或37℃振荡1小时后，高温高压灭菌1小时水解残留的DEPC；

2）由于DEPC可以和初级氨基基团起反应，故含Tris的溶液不宜用DEPC处理。应使用新开瓶（RNA专用）的Tris粉末，溶于DEPC处理水或Milli-Q水中，适用RNA专用电极调整pH值后，高温高压灭菌；

3）对于遇热不稳定的化合物(如DTT、核苷、锰盐等)，应直接将其(最高纯度)溶于DEPC处理水或Milli-Q水中，使用0.2 μm的滤膜过滤灭菌；

4）无水乙醇、异丙醇等试剂开瓶后作RNA专用；75%乙醇应使用无水乙醇与DEPC处理水配制；

5）反应体系中添加RNA酶抑制剂。