激光应用中的滤光片和反光镜

在荧光应用中使用激光作为照明光源需要特别注意光路的问题。需要特别注意的地方集中在光的相干性、小的光束直径、光偏振以及光功率。在一些情形下，锥体角(入射角)、系统中存在的散射都是在光路设计中需要考虑的重要影响因素。虽然光路设计中需要对整个光路考虑周全，但这篇文章将着重讲解在光路中使用到的滤光片和分光镜。

在经典的仰角位置光照配置中有3种光件扮演着重要角色，分别是：激发片，二向色镜/分光镜、发射片。通常这些镜片被安装在一个立方盒底座上，这个底座可以根据需要插入或者从显微镜上移除。

在这个标准的荧光显微镜范例中，激发片可以阻断所有从深紫外到近红外波段的非荧光染料激发波段的光。通常这是一个具有30到60纳米半峰全宽(FWHM)的带通滤光片。在标准的显微镜中，这些镜片没有表面平整度规格或透射波阵面的要求。楔可以很大(通常是少于8弧分)，划痕/戳的规格最小是80/50。可以有小到无法衡量或观察不到的针孔。通常这里不用过分担心样品自发荧光的问题，因为这个镜片被放置在成像路径之外。这个镜片通常来讲不是增透镀膜的并且采用浮法玻璃作为基片。这些激发片都是零度入射角设计的。

与epi平台相比，激光系统尽管大多数使用的还是上面列出的三种镜片但是他们的配置差异极大。这些滤光片和镜片通常并一定安装在一个底座/立方盒上，它们在光路中的位置也是根据系统的不同而变化。

在激光的应用中，大多数滤镜的规格要求有明显不同。纯化滤光片(用于激光的激发片)必须仅对来自激光的不需要的波段有过滤作用。现在还有很多用户认为激光不需要纯化滤光片，这不是正确的。几乎所有的等离子体激光器会产生多条不同功率的谱线，并且新一代的二极管发射谱具有更宽的半峰全宽。此外，它们也可能会有远离主要谱线的噪声。二极管泵浦固态激光器在它们的输出中通常会有非常窄发射谱，但是它有可能被泵浦源或主要谱线所污染。由于这些原因，所有的激光系统都要进行有或没有纯化滤光片时的信噪比检测。透射波阵面必须优于每英寸一个波，尽管有些应用中的要求是每英寸1/4个波或者更好。楔必须小，一个弧分以内，且没有针孔。必须事先考虑到样品的自发荧光，并且必须划痕/戳的规格不低于60/40。这些滤镜通常具有10-20纳米的半峰全宽，是经打磨和抛光过的，并且在任一面都是增透镀膜，而不是干涉镀膜。尽管标准的激光应用使用浮法玻璃作为基片效果非常好，拉曼技术以及其它的应用可能需要用熔融石英玻璃来消减光路中可能存在的任何自发荧光的。纯化滤光片被设计成适合于3-5度的入射角以确保反射的激光不会回到激光震荡腔中。如下图1。



配置中的第二种镜片是二向色镜，也叫做分光镜，在广义的epi系统中它通常会有如下规格：少于每英寸10波的表面平面度，少于每英寸1个波的透射波阵面，少于或等于一弧分的楔，40/40的划痕/挖痕。二向色镜应该用熔融石英玻璃制成，因为它被放在epi系统的激发路径和反射路径中。对于标准的应用，这种镜片不需要是增透镜片。这些镜片被设计成长通滤光片(反射短波光而透射长波光)或者短通滤光片(透射短波光而反射长波光)。在标准的显微镜配置中二向色镜被设计成45度的入射角从而使得激发光的角度改变90度。

在激光应用中，分色镜有更严格的规范要求：在镀膜之前有小于每英寸1/2个波的表面平面度，小于1/4个波的透射波面畸变，小于5弧秒的楔，以及通常为40/20的划痕/挖痕。所有的激光镜片都需要增透镀膜以减少激光的二次反射和散射，同时增强透射。大多数商业用的显微镜号称是1毫米厚的二向色镜，这就要使用较厚的熔融石英玻璃才能更容易满足这些要求。由于以上原因，激光应用系统常常会使用较厚的镜片/二向色镜。当大多数的激光镜片被设计成45度入射角时，一些当前流行的甚至更新版本的共焦显微镜使用10-15度入射角镜片来增加反射率(即增加阻塞)以及使偏振影响最小化。所有以上的规范都被认为是最低限度的要求，因为在某些应用中还要求这些镜片达到更高的标准。

二向色镜需要考虑的另外一个因素是激光的偏振。镜片的设计要求在零度入射角下没有偏振，但是任何一个镜片在一定的入射角下都有着起偏器的作用，入射的角度取决于具体的设计。因此，所有激光镜片都需要考虑激光的偏振性质。见图2。


对于分色镜需要考虑的另一个要素是在任何基片例如熔融石英玻璃上镀膜都会产生应力。这种应力可能很小以至于不易察觉，但确足以在光束中导致极端的散光。较厚的基片基本能够帮助解决这个问题，但仅仅靠它还有可能不够。因此，多数制造商会有专门的办法来中和这种应力，并且这些镜片的反射特性也要严格兼顾到。需要注意的是透射波阵面是依赖于基片的外表面的平整度，通常不受任何涂层的影响。

导致产生应力的另外一个可能原因是安装该镜片到系统中的方法。放置该镜片的45度卡座的表面应该被抛光得类似于基片的表面平整度(例如每英寸1/2个波)，并且任何支撑该镜片在其位置上的物体不能产生任何不均的压力。这些影响在TIRF(全内反射显微镜)中是最明显的，并且可能会要求用一个完全定制的的立方体底座来代替标准的显微镜底座。

发射片是配置当中的最后一种镜片了，也经常被叫做隔紫外滤光片。该镜片的主要功能是阻止激发波段光到达探测器(人的眼睛或是电子探测设备)。它的第二个功能是透射来自目标染料的所需荧光。这就意味着发射片必须高消光阻塞任何透过激发片的光。阻塞通常是用光密度(OD)来衡量，它是透过率(T)的对数，在广泛的应用领域它的取值范围在OD 3到OD 6之间。这种镜片要么是带通的，要么是长通的，其典型的规格要求为：小于每英寸1波的波阵面，小于一弧分的楔，60/40的划痕/挖痕。增透镀膜可以根据特殊的应用进行选择。

对于激光应用，对发射片的最低要求就跟上面定义也很接近，除了一点，对激光束的阻塞应该最小为OD 6，并且在所有的情况下都应该使用增透镀膜。这些发射片也被设计成0-5度的入射角，就像许多现代的宽场系统一样，以减少内部的反射。如下图3。

标准的激光扫描共焦系统
典型的激光扫描单元要求满足上面列出的规范同时还需要考虑发射片是放在转轮中还是分流单元中。如果共聚焦显微镜只有一个探测器(通常是一个PMT)或使用发射片转轮来顺序成像，那么用于每一个激光束的发射片必须只能过滤那一束激光。多探测器系统则使用发射分光二色镜来控制光线。这些分色镜不需要比普通镜片满足更多的规格要求，但是在一些应用中需要有增透镀膜来保证成像质量。

就像上面提及到的，一些新一代的激光扫描单元使用一个普通二向色镜，其入射角不是45度而可能是10-15度，但是，分光二向色镜通常是45度入射角。


多针孔共聚焦显微镜
目前的商业Nipkow Disk共聚焦显微镜有两个完全不同的光束路径。一个是使用初级的分色镜来反射激光因此它非常类似于标准的共聚焦配置。另一个类型是使用初级分色镜来传输激光到样本上，然后再反射这些激发光到探测器上(通常是CCD摄像机)。多个原因都使得这类透射分色镜的设计非常困难。二向色镜在一定程度上更难设计和制造是因为要求具有非常窄的透射波段和宽的反射波段。这种设计意味着甚至多得多的激光最终会被反射到探测器上(也在不同的角度)，因此就需要特别强调发射片的过滤能力。由于这些透射镜片是放置在光程的聚焦路径中，基片的厚度是受到限制的，这使得波阵面畸变控制变得更加复杂。如图4所示。


全内反射荧光显微镜，TIRF
全内反射荧光显微镜最初的设计是使用棱镜使激光束射到细胞粘附的交界处。这样做存在着经常需要校准的问题，但是从滤波片的角度来看，它更直截了当，因为被反射的激光不会被物镜收集。然而，后来发展的通过镜头取景式的全内反射荧光显微镜带来了不一样的环境条件，即激光激发光事实上被物镜吸收了。因此，激光可以毫无损耗地被反射回光路中。反射光线要求全内反射荧光显微镜应用中的二向色镜和发射片能够处理大量的反射激光。激光会给任何往显微镜中看的人造成危险，因此它通常被激光遮挡设备过滤掉。

就像之前提到的，全内反射荧光镜应用中的二向色镜的反射波阵面畸变(RWD)必须满足相当严格的标准，通常是以表面平整度为每英寸0.1波和透射波面畸变为每英寸0.1波的基片开始。必须非常注意使用的镀膜不要给基片带来超过可接受水平以外的压力。由于系统可能会变化，这项要求可以是在镀膜之后每英寸0.25到1个波的表面平整度。

在全内反射荧光显微镜设备中，发射片的阻塞必须大于OD 6，并且在许多应用中甚至要达到OD 8。仅在几年前，这还被认为是不可能的，但由于使用了高级的镀膜技术和非常特殊的诀窍之后，现在已经是相当普遍了。

系统设计造成的高角度反射使得全内反射荧光显微镜成像相当复杂，因为干涉滤波片都被设计成0-5度的入射角。超过了这些圆锥角的光线会使滤波片的cut-on朝向紫外方向偏移，即朝向激光源。因此，此类系统中的高角度激发光要求发射片具有一定的cut-on红移来避免上述想光源的偏移效应同时还保持完整的阻塞能力。在这种情境下的另外一个选择是使用吸收玻璃，它不依赖于角度变化，但是能大大降低滤波片的透射率。

在目前的通过镜头取景式的全内反射荧光显微镜系统中，在立方盒(底座)中或靠近镜片二色镜中使用发射片是非常普遍的，并且在探测器发射片转轮前面放置第二个发射片。在立方盒中放置一个好的阻塞发射片也大大增加了安全系数，以防止某人意外地在没有激光锁的情况下向显微镜中看过去而受伤。这种双保险的发射设计在一些系统下是绝对有必要的，但在另外的系统中就不一定。这里需要说明的是标准的非常窄的凹口滤光片在这些应用中效果不是非常好，因为这种类型的滤光片对入射光的角度非常敏感。如下图5和图6。



多光子系统，三分之二激光系统结构
发展满足早期的理论参数的双光子成像系统(通过使用高功率脉冲激光在两杯激发波长处激发荧光基团)，对于滤光片生厂商而言存在很大的技术难题。对于这些系统，在非扫描模式下，主要的镜片应该是短通设计的，即反射长波长的波段而透射短波长的波段。这种镜片必须被设计得反射和透射的效率都相当高，并且保证入射的脉冲光线没有任何的色散，因为这会明显降低峰值的功率。这种新技术也意味着这些系统中的阻塞滤光片对波长较长的波段有最大化的阻塞效果，而单光子激光显微镜恰好相反要在短波有较好的阻塞作用。全新的滤光片设计必须是长时间不断的研发和完善以满足目前要求在全部参数调整范围内的激光的阻塞达到的OD 8+的水平。如下图7。


为了深入完善滤光片的设计，许多人想使用二次谐波(SHG)成像和做3光子激发，这些都要求二向色镜和发射片能够透射紫外范围的光。这可能是设计中最困难的一部分，但现已通过干涉技术来实现。如图8。

有更多的用户使用非再扫描探测(NDD)系统，发射信号不通过主要的分色镜。这些系统通常直接将荧光从样本传输到探测器。在光路开始的位置(见图7、图8)，探测器或者是多探测器系统中的每一个探测器的前面安装带通发射片，可能会是一个短通发射片，来阻塞激光。这些通常被安装在立方盒底座上以简化光束路径。如图9。


相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)显微技术

这种新技术，得到了哈佛大学谢晓亮(SunneyXie)博士的支持，是一种要求有包含多种波长泵浦激光和斯克托斯激光的成熟多光子应用。由于这些激光功率巨大，可能还需要另外的阻塞能力，可能要超过上面提到的标准双光子系统中OD 8+的水平，并且连续使用两个阻塞镜片的情况也非常普遍。如下图10。


拉曼光谱

拉曼技术已经存在很多很多年了。目前最常见的是被应用在关于长波激光的正斯克托斯拉曼信号上(使用长通二向色镜和长通发射片)。有时候，研究者更喜欢看负的斯克托斯拉曼反应(使用短通二向色镜和带通或短通发射片)。每一种应用都需要特殊的镜片或滤光片，但是主要的要求是尽最大努力阻塞激光，因为拉曼信号非常低。通常拉曼信号太低，所以光学镜片包括纯化滤光片和发射片必须采用熔融石英玻璃而不是浮法玻璃制作，以减少系统中出现的任何的自发荧光。此外，二向色镜和发射片还必须被设计得尽量靠近激光束。幸运地是，许多正的斯克托斯实验能够使用长通发射片，这种发射片更容易设计成离激光束只有几毫微米，并且仍然能获得最佳的激光过滤效果。如图11。

激光阱和光镊

通常，这些系统使用一个1064纳米的激光束或者类似聚焦束照射标本平面。为了达到这个目的，大多数的系统使用一个能反射近红外光(NIR)和透射可见光的长通分色镜。此外，所有的发射片必须能够阻塞激光阱，就像上面描述的类似于双光子的阻塞。如图12。

流式细胞术

由于流式系统使用激光器，即使一些规格由于这些机器固有的能力通过在其计算中使用激光光散射和激发光来消除噪音得以放宽，他们也需要特别考虑。这些系统不使用成像组件通常是不能成像的。流式细胞仪光学检测技术的最大的挑战之一就是从越来越多的荧光染料中同时收集信号所带来的困难。这就意味着二向色镜(可能是长通也可能是短通，这要取决于设备的设计)和发射片在相同的发射路径中可能被设计成适合4到6种不同的荧光染料。这就迫切需要将分色镜设计得非常陡，并且陡而窄的发射片设计还必须满足市场上不同流式系统一般化设计的要求。完整的流细胞术应用的内容可以在网站www.chroma.com上查看。