细胞技术专题：大鼠肝星状细胞培养实验
实验方法
- 细胞培养技术
| 实验方法原理 | 选用Wistar大鼠经消化酶灌注肝脏后,用分离液分离HSC，通过观察其自发荧光及其显著特征性结构的脂肪染色、细胞免疫化学染色等方法鉴定。 |
|---|---|
| 实验材料 |
雄性 SD 大鼠 |
| 试剂、试剂盒 |
戊巴比妥钠 小牛血清 DMEM 酶消化液I、Ⅱ Nycodenz D-Hanks’液 HBSS 台盼兰 |
| 仪器、耗材 |
手术器械 尼龙网 相差显微镜 荧光显微镜 |
| 实验步骤 |
一、实验步骤 1. 大鼠腹腔麻醉后在超净台上剖腹，进行门静脉插管。
2. 以D-Hanks’液灌注，同时剪开下腔静脉，冲掉血液后，改灌以100 ml 酶消化液I(0.05% IV 型胶原酶)。
3. 待肝脏变软后，离体肝脏并剪碎，继续以酶消化液II(含20U/ml DNase I 的0.05% IV 型胶原酶)消化15 min，尼龙网过滤后以450 g 离心5 min(4℃，下同)。
4. 以HBSS 重悬沉淀至10 ml，再混以20 ml Nycodenz 液，分置于离心管中，并分别覆以2-3 ml HBSS，1450 g 离心16 min 后取界面细胞。
5. 以HBSS重悬后再次离心收集细胞，以DMEM重悬后进行细胞计数，并判断存活率和产量，最后按照常规方法接种(105 细胞/cm2 )，次日换液，以后每2-3 天换液一次。 6. 传代方法：弃去培液后以D-Hanks’液洗两次，加0.125%胰酶(原代最好加0.05% EDTA)消化，镜下观察细胞突起回缩(2-5 min左右)，以完全培液(DMEM+10% NBS)终止反应(若不用EDTA，可以不需离心)， 充分吹打后以 1:2-1:3 接种，然后继续培养(5% CO2，37℃)。
接种次日，光镜下可见细胞呈星芒状，胞质内有脂滴，荧光镜下328 nm 处见自发荧光。附照片(图 1)。
图 1. 原代培养第 2 天的大鼠肝星状细胞 |
| 其他 |
一、讨论 进一步鉴别需要做免疫组化：Desmin 和α-SMA；后者在细胞激活后才表达。也采用过无须原位消化的方案，完全可行，只不过消化时间更难控制！实验采用原代培养的或传代后9代内的细胞(最好5 代以内)。 二、文献 1. 袁桃霞，张锦生，张月娥，等. 大鼠肝 Ito 细胞的体外培养及肝素对其抑制作用的观察. 上海医科大学 学报,1996,23(2):90-93.
2. Huang GC, Zhang JS, Tang QQ. Involvement of C/EBP-α gene in in vitro activation of rat hepatic stellate cells. Biochem Biophys Res Commun,2004,324(4):1309-1318. |
