细胞技术专题：小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)原代培养实验
小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)原代培养可以：（1）用于细胞保种；（2）用于分子生物学研究；（3）用于基因治疗相关研究。
实验方法
- 胰酶消化法1
- 胰酶消化法2
| 实验方法原理 |
将小鼠的胚胎成纤维细胞（MEF）从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置MEF生长培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。 |
|---|---|
| 实验材料 |
孕鼠 |
| 试剂、试剂盒 |
PBS EDTA 胰酶 MEF生长培养基 FBS 高糖DMEM |
| 仪器、耗材 |
眼科直剪 眼科直镊 眼科弯镊 玻璃平皿3 尼龙滤网 离心管 手术刀片 |
| 实验步骤 |
一、实验材料准备
1. 动物
孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。
2. 试剂
无Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.05%胰酶、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF生长培养基(高糖DMEM加10%FBS)。
3. 器械
眼科直剪3把、眼科直镊3把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套、200目尼龙滤网、50 ml和15 ml离心管和手术刀片。以上物品均需要高压灭菌消毒处理。
二、具体操作 1. 处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开，用另外一组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出子宫，最后用第三组剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。 2. 用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30 ml D-PBS的50 ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉D-PBS，再重复此步骤一次，注意要留少许D-PBS，然后将胚胎转移到另一装有D-PBS的平皿中，并用手术刀片将其细细切碎。
3. 用200 μl的移液枪反复、快速地吹打平皿中的液体，转移至15 ml离心管中，于4℃ 1500 rpm离心5分钟，倒掉上清，以10 ml胰酶重悬沉淀，放在37℃水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。
4. 将上层细胞悬液倒入一个装有10 ml MEF生长培养基的50 ml离心管中，用200目的尼龙网过滤后，以1 500 rpm离心5分钟收集细胞，再用30 ml MEF生长培养基洗涤两次。
5. 细胞沉淀用15 ml MEF生长培养基重悬后进行细胞计数(一般8只14天的胎鼠可获得2-3×107细胞)。
6. 3×106细胞悬浮于15 ml MEF生长培养基中，接种到200 ml培养瓶中。
7. 24小时后更换新鲜的MEF生长培养基。
8. 细胞长满后，先用D-PBS冲洗，倒掉后加胰酶消化(此步时间不宜过长，作者一般不超过五分钟)，按1:5传代。
9. 细胞再次长到覆盖率80-90%左右，将其消化后，常规冻存(冻存液要现配)。
  小鼠胚胎成纤维细胞(MEF 100倍) |
| 注意事项 |
1. 原代培养，一定要避免污染。
2. MEF生存能力有限，如果不冻存，体外存活十代左右。
3. 冻存后复苏的细胞只能传代一次，因为这些细胞繁殖能力有限。
4. 消化细胞时间不要过长。 |
