感受态制备：枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备实验
实验方法
- 化学法
- 化学改进法
| 实验材料 |
枯草芽孢杆菌168 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 |
SPI 培养基 EGTA SPII 培养基 柠檬酸钠 EGTA 氢氧化钠 KH2PO4 K2HPO4 MgCl2 MgSO4 葡萄糖 酵母膏 ( NH4 )2SO4 |
| 仪器、耗材 |
培养箱 培养皿 锥形瓶 紫外分光光度计 接种环 离心管 |
| 实验步骤 |
一、试剂配制
1. SP 盐
0.2%( NH4 )2SO4，1.4% K2HPO4，0.6% KH2PO4， 0.02% MgSO4·7H2O， 0.1% 柠檬酸钠。 2. CAYE (100×)
2 % Casamino acid，10%酵母膏。 3. SPI 培养基
SP 盐溶液加入1 %体积浓度为50%葡萄糖溶液，1 %体积100×CAYE 溶液。 4. SPII 培养基 SPI 培养基加入1 %体积50 mmol/L CaCl2 溶液，1 %体积250 mmol/L MgCl2 溶液。 5. SP-A Salts Solution(500 ml)
（1）0.4% (NH4)2SO4 ：2 g （2）2.8% K2HPO4·3H2O ：14 g （3）1.2% KH2PO4 ：6 g （4）0.2% Trisodium Citrate Dihydrate ：1g （5）121°C灭菌20 min。 6. SP-B Salts Solution(500 ml)
（1）0.04% MgSO4·7H2O： 0.2 g （2）121°C灭菌20 min。 7. 100×CAYE Solution(100 ml)
（1）2% Casamino acid ：2 g
（2）10% Yeast Extract：10 g （3）121°C灭菌20 min。 8. SPI Medium(20 mL)
SP-A Salts Solution：9.8 mL SP-B Salts Solution：9.8 mL (1%V)Glucose(50%w/v，115°C灭菌20 min) ：200 μL (1%V)100×CAYE：200 μL 10. SPII Medium(6 mL)
SPI Medium：5.88mL (1%V)50mM CaCl2 ：60μL (1%V)250mM MgCl2：60μL 11. 100×EGTA Solution
10mmol/L EGTA 溶液，溶解时需加少量NaOH 至pH8.0。 二、实验步骤 1. 准备新鲜的168 单克隆平板，取一满环枯草芽孢杆菌甘油菌划LB 平板，37°C 培养箱培养12 h。 2. 转化前一天晚间挑单菌落至3 ml LB 培养基中，37°C，250 r/min 培养过夜。
3. 第二天上午取160 μl 培养液转接至8 ml SPI 培养基中，37°C，250 r/min 培养至对数生长末期(168 约4-5 h)。
4. 取0.2 ml 生长至对数期末的培养液至2 ml SPII 培养基中，37 °C，100 r/min 培养90 分钟。
5. 在上述SPII培养基的菌体中加入20 μl 10mmol/L EGTA，再于37°C，100 r/min 培养10 分钟。
6. 将上述处理后的菌液分装成0.5 ml 每管，各加入5 μl DNA(DNA 量不能过高，不超过5 μg)，再于37 °C，250 r/min 培养90 分钟，取菌液涂布筛选平板。
收起 |
| 注意事项 |
1. 注意仪器用品的干净和无菌。 2. 8ml SPI 培养基要放于50 ml 离心管中培养，以保证菌体的生长状态，不要使用玻璃试管。 3. 注意测定OD值，一定要等菌体生长至对数期后期。 4. 保证菌体的浓度，可以提高转化率。 |
