β-AP对衰老模型大鼠开场行为及学习记忆能力的影响

β-AP对衰老模型大鼠开场行为及学习记忆能力的影响

　　摘要:用D-半乳糖(D-gal) 建立衰老动物模型且海马内微注射βAP ,检测各组大鼠开场行为、Y-迷宫分辨学习和一次性被动回避反应的变化的方法,研究β-淀粉样蛋白(βAP) 对衰老大鼠开场行为及学习记忆能力的影响. 结果是D-gal + NS 组、D-gal +βAP 组大鼠在新异环境中自发活动和探究行为减少,学习记忆减退,与NS + NS 组比较有显著性差异( P < 0. 05 , P < 0. 01) . 该文得出的结论是βAP 与D-gal 联合使用可导致脑老化程度加重,学习记忆能力显著减弱.

关键词:β-淀粉样蛋白; 开场行为; 学习记忆; 衰老

　　β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein ,βAP) 是老年性痴呆患者的大脑中特有的一种蛋白,它在老年性痴呆的发病机理中的作用已引起人们的重视. 生化研究表明,β-淀粉样蛋白是老年性痴呆患者脑海马和皮层老年斑(SP) 的主要成分,它与AD 的病理形成过程关系密切. 已有报道βAP 对正常大鼠海马神经元的毒害作用[1 ,2 ] ,但有关βAP 对衰老大鼠的作用,国内外均未见报道,本实验试图在D-半乳糖所致衰老动物模型基础上进行海马内注射βAP ,观察其对大鼠开场行为和空间分辨学习以及记忆保持能力的影响.

1 　材料与方法

1. 1 　动物和试剂

雄性健康SD 大鼠,体重100～120 g,βAP 为Sigma 公司产品(βAP1 -40 ,Lot NO.76H49611) ,D-半乳糖(D-gal) 为上海试剂二厂产品.

1. 2 　分组和模型建立

将大鼠随机分成4 组: ①生理盐水NS + NS组; ②NS +βAP 组; ③D-gal + NS 组; ④D- gal +βAP组. ③、④组动物腹腔注射D-半乳糖:50 mg·kg - 1·d - 1 ,连续注射6 周建立衰老动物模型[3 ] ; ①、②组动物腹腔注射等量生理盐水. 于第4 周进行双侧海马内注射βAP , 每侧注射1μL (4μg/μL) ;对照组注射等量生理盐水. 海马定位注射方法:大鼠腹腔注射4 %戊巴比妥钠(40 mg. kg - 1) 麻醉,立体定位仪(日本NARISHIGE SN - 3 型) 上固定,坐标按照图谱[4 ] ,以前囱定位:AP = - 3. 5 mm ,ML = ±2. 0mm ,H = 2. 7 mm ,钻开颅骨,用微量进样器垂直进针,每侧注射时间为5min ,留针5min ,缓慢起针,局部消毒后缝合皮肤,肌注抗生素抗感染.

1. 3 　行为学检测

连续腹腔内注射6 周后进行.

1. 3. 1 　开场行为(open field) [5 ] :

将动物置于圆形开场检测箱底中央的格内,记录其在3 min 跑动(locomotion) 穿过的格数,后肢站立( rearing) 次数、梳理(groo ming) 次数及粪便颗粒数. 比较不同组间大鼠在新异环境中自发行为和探究行为表现的差异.

1. 3. 2 　Y - 迷宫分辨学习( Y-maze discri minationlearning) 能力检测[6 ] :Y-迷宫为三等分辐射式反射箱. 以大鼠被电击后逃至安全区为一次正确反应,连续10 次测试中有9 次(90 %) 正确反应,定为学会标准. 记录每个大鼠达到学会标准的训练次数. 所有检测过程均由计算机完成.

1. 3. 3 　一次性被动回避反应(one- t rial passiveavoidance response) [5 ] :

根据大鼠趋暗习性,记录其在通道上的停留时间,即步入潜伏期(step- through latency , STL) ;动物进入暗箱后立即给予电击(0. 3 mA ,5 s) ;24 h 后检测大鼠的STL. 以STL 作为记忆保持的指标,STL越长表明对电击的记忆保持越好. 检测以240 s 为限.本实验数据用( X ±S .X ( X 表示,组间差异用t检验;一次性被动回避反应采用Mann-whitney 非参数检验.

2 　结　　果

2. 1 　不同组大鼠开场行为观察

结果见表1，统计处理表明,在开场行为诸参数中,D-gal +βAP 组动物与NS + NS 组比较粪便颗粒数有显著性差异( P < 0. 05) ,而跑动格数则极明显减少( P < 0. 01) ,前者在新异环境中自发活动和探究反应明显下降,紧张恐惧状态也降低. D-gal + NS组动物跑动格数与NS + NS 组比较也有显著性差异( P < 0. 05) . NS + NS 组与NS +βAP 组之间虽无显著性差异,但其跑动格数、站立次数均有下降趋势,说明βAP 单独使用对大鼠在新异环境中的自发活动及探究行为也有一定影响.

表1 　β-淀粉样蛋白对大鼠开场行为的影响

组别             n      跑动格数         后肢站立次数     粪便颗粒数

NS + NS      10  86. 6 ±7. 5        23. 6 ±2. 3     4. 0 ±1. 9

NS +βAP      9   73. 8 ±9. 6        20. 3 ±3. 1     3. 1 ±2. 0

D-gal + NS   9   69. 3 ±9. 8^*      18. 8 ±1. 9     3. 0 ±1. 6

D-gal +βAP  9   46. 7 ±5. 8^**△  15. 7 ±2. 2     1. 3 ±0. 2^*

*P < 0. 05 , **P < 0. 01 vs NS + NS group ,

△P < 0. 05 vs D-gal + NS group.

2. 2 　Y-迷宫分辨学习能力检测

达到学会标准所需训练的次数,NS + NS 组:21. 4 ±2. 6 ;NS +βAP 组:34. 6 ±5. 5 ;D-gal + NS 组:42. 4 ±5. 4 ;D-gal +βAP 组:48. 0 ±5. 6. 前两者比较无显著性差异( P > 0. 05) ,D-gal + NS 组与NS + NS组比较有显著性差异( P < 0. 05) ,而D-gal +βPA 组与NS + NS 组比较,达到学会标准所需训练次数极明显增加( P < 0. 01) ,说明D- gal 所致衰老模型大鼠的分辨学习能力显著降低,而在衰老动物模型上海马内注射βAP 更使学习能力极显著下降.

2. 3 　一次性被动回避反应

从表2 可见D-gal +βAP 组记忆保持能力明显下降,电击后24 hSTL 显著缩短,与NS + NS 组和D- gal + NS 组比较有显著性差异( P < 0. 05) . 其他组之间比较,差异无显著性,但记忆保持能力呈逐渐降低趋势.

表2 　β-淀粉样蛋白对大鼠步入行为的影响

                     STL (s)

 组　别           电击前            电击后24 h

                 中位数    四分位数   中位数     四分位数

NS + NS       24      10 - 35      216      73 - 240

NS +βAP       25      10 - 29     152       15 - 240

D-gal + NS   23       20 - 34     188       55 - 240

D-gal +βAP   33       22 – 77    108^*△   58 - 240

*P < 0. 05 vs NS + NS group. △P < 0. 05 vs D-gal + NS group.

3 　讨　　论

有研究报道,对大鼠连续注射D-半乳糖引起拟衰老效应[7 ] ,可导致动物学习记忆能力下降,脑内超氧阴离子自由基水平增高, 超氧化物歧化酶(SOD) 活性降低,丙二醛和脂褐素含量升高. 这说明D-半乳糖诱发的自由基蓄积引起的脂质过氧化损伤,是产生拟衰老变化的原因,这必然也会引起衰老性脑功能的衰退.βAP 是老年性痴呆患者最早出现的典型的病理学特征. 一些学者认为,βAP 可引起学习记忆减退、认知障碍等[8 ] ,是AD 各种病理和临床表现的始发因素. βAP 具有沉积作用和神经毒性,较高浓度的βAP 能引起神经退化和死亡[1 ] ;βAP 的神经毒性作用可以增强或加大各种伤害性刺激的细胞损伤效应,此外它还具有直接的细胞毒性[9 ] . 但Morimoto报道,在大鼠海马神经元,单独注射βAP 不能产生特定的神经毒性作用,仅能引起少量的神经元变性[10 ] . 无论在体外培养细胞,还是在体内研究中,βAP 是否具有神经毒性作用还存在着争议,其原因可能是所用βAP 的浓度不同所致[11 ] . 本研究结果表明海马内单独注射βAP 不能引起明显的行为学变化,但在衰老动物模型基础上经βAP 处理后,可导致动物自发活动及学习记忆行为明显降低,说明D-半乳糖和βAP 有叠加效应. 学习记忆是脑的高级功能,学习记忆减退是脑功能衰退的表现. 因此,本实验结果提示,在D-半乳糖所致衰老动物基础上,海马内注射βAP ,可望作为更接近AD 的一种动物模型. 但它是否具有AD 的各种病理学特征,还有待于做进一步研究。

 

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