人可溶性α–klotho蛋白检测试剂盒使用说明书

前言简介
α–klotho是经基因改造(类似患有人衰老症状)小鼠体内的一种负调节基因，其基因序列存在多个种属，包括基于小鼠研究的人类，α–klotho蛋白是一种分子量约为130kDa的横跨膜蛋白，在肾脏和甲状旁腺内表达.
近年来，已证实α–klotho是机体调节矿物质代谢的重要因子，如钙和磷的代谢.因此认为,小鼠幼龄老化症状就是因为α–klotho的缺失导致矿物质稳态破坏而引起的. 同时，据报道,构成α–klotho蛋白序列主要部分的长N-端胞外域可经分离释放至血液.然而对于可溶性α–klotho蛋白发挥的功能和变化仍存很多疑点，所以急需研制一套α–klotho检测系统
此ELISA试剂盒可用于检测人血液的α–klotho蛋白

实验原理
此固相ELISA试剂盒基于夹心法原理，利用两种不同的高特异性抗体，TMB作为底物显示剂，显色强度与人可溶性α–klotho的量成正比

检测范围
93.75~6000pg/mL

预期用途
此试剂盒可用于血清，血浆和尿液中人可溶性α–klotho的定量检测

试剂盒组成

1、   包被板: 包被有抗人可溶性α–klotho（67G3）小鼠IgG单抗，亲和纯化      96T x 1

2、   浓缩标记抗体: (30X) HRP标记的抗人可溶性α–klotho小鼠IgG Fab’亲和纯化              0.4ml x1

3、   标准品: 重组人可溶性α–klotho                                         0.5mlx2

4、   EIA缓冲液:                                                           30mlx1

5、   标记抗体稀释液: 1%BSA，含0.05%吐温20的PBS                          12mlx1

6、   显色剂:TMB底物液                                                    15mlx1

7、   终止液: 1N硫酸                                                       12mlx1

8、   浓缩洗涤缓冲液: (40X)含0.05%吐温20的磷酸缓冲液                       50mlx1

实验所需材料( 但试剂盒未提供)
酶标仪（450nm）      微量移液管和加样枪头
量筒和烧杯            去离子水
吸水纸                坐标纸
标准品稀释管           洗瓶
一次性试管

试剂准备

1、   洗涤缓冲液的准备：

先将(40X)洗涤浓缩液平衡至室温，充分混匀，取50ml浓缩液与1950ml的去离子水混匀，即得. 稀释洗涤液应保存于冰箱内，2周内用完

2、   酶标记抗体的准备：

用标记抗体稀释液将标记抗体稀释至30倍，即得
例：如果只测一条板，8孔，则需要标记抗体800ul（30ul的标记抗体+870ul的标记抗体稀释液，混匀，使用时每孔各加100ul）
此步骤应在标记抗体使用前完成
剩余的标记抗体浓缩应装于密封瓶内，于4℃保存

3、   标准品的准备：

吸取0.5ml的去离子水至标准品瓶内，充分混匀，得到12000pg/ml的人可溶性α–klotho标准品

4、   标准品的稀释：

准备8个试管用于标准品的稀释，各加230ul的EIA缓冲液, 配制成以下8管浓度
1号管                 6000pg/ml
2号管                 3000pg/ml
3号管                 1500pg/ml
4号管                 750pg/ml
5号管                 375pg/ml
6号管                 187.5pg/ml
7号管                 93.75pg/ml
8号管                 0pg/ml（试验样品空白）
吸取230ul的标准品于1号管混匀，然后从1号管吸取230ul加入2号管混匀，如下图所示,按此规律稀释，标准品范围为6000~93.75pg/ml. 8号管作为样品空白,浓度为0pg/ml.

5、   样品稀释：

根据要求,用EIA缓冲液稀释样品.血清,血浆或尿液样品建议稀释2~4倍

实验步骤
使用前，将所有试剂应平衡至室温，大约30min，充分混匀，确保试剂质量无变化，标准曲线和样品检测同时进行.

试剂	检测样品	标准品	样品空白	试剂空白
	检测样品100ul	稀释标准品（1-7管）100ul	EIA缓冲液（第8管）100ul	EIA缓冲液100ul
盖板，于室温下温育60min
洗板7次
酶标抗体	100ul	100ul	100ul	-
盖板，于室温下温育30min
洗板9次
显色剂	100ul	100ul	100ul	100ul
室温避光温育30min
终止液	100ul	100ul	100ul	100ul
加终止液,30min内于450nm处读取OD值

 

特别注意

1、   试验样品采集后应立即检测或冻存,避免反复冻融样品,检测前应在低温下先将其完全溶解混匀尤其是尿液样品，温度和冻融对其比血浆或血清稳定性影响更大,所以样品采集后应立即冻存，避免重覆冻存

2、   试验样品根据所需,用EIA缓冲液稀释

3、   建议各试验样品和标准品做双份检测

4、   试验样品应在中性PH范围，有机溶剂的污染可能会影响实验结果

5、   只能用本试剂盒提供的洗涤液洗板，不充足的洗涤会导致试验失败

6、   用吸水纸拍干微孔板，避免刮擦

7、   TMB底物液应贮存于黑暗处，因其对光敏感，且避免接触金属

8、   加入终止液后,30min内必须读数

结果计算
绘制标准曲线前，所有的数据(包括标准品和未知的样品)都应减去试验样品空白值.以标准品的浓度及相对应OD值，在坐标纸上绘制标准曲线,从标准曲线上可直接读取未知样品的浓度
 

此标准曲线仅供示例演示,不能用于获取试验数据.每次检测都应建立其标准曲线.
 
 
本译文仅供参考，详情请以原文为准。