新生儿促甲状腺素（TSH）检测试剂盒使用说明书

 

德国IBL进口原装，酶标仪定量检测

 

中国SFDA注册：国食药监械（进）字2011第2400471号

【产品标准编号】SFDA(I)20112400471

 

    本试剂盒为体外测定试剂盒，用酶联免疫法定量测定滤纸片上干燥血标本中的促甲状腺素（hTSH），作为新生儿先天性甲状腺机能减退症（简称“甲低”）的筛查。

     先天性“甲低”是以外周血甲状腺激素（T3和T4）水平降低为特征的新生儿内分泌障碍。世界范围内先天性“甲低”的平均发病率为1：4，000。此疾病特点是外周血中甲状腺激素低于正常水平，而促甲状腺素高于正常水平。人的促甲状腺素是由脑垂体前叶合成分泌的。他调节和刺激甲状腺产生甲状腺激素。甲状腺激素缺乏刺激hTSH分泌，存在负反馈。hTSH水平也受下丘脑分泌的促甲状腺素释放激素的影响。因此，新生儿外周血促甲状腺素浓度提高，可作为筛查判断先天性“甲低”的根据。

     新生儿出生前后时期和出生后几个月内甲状腺激素的不足将妨碍其大脑的正常发育，其最终结果是导致不可修复的大脑功能障碍和骨骼神经系统发育障碍。早期筛查出新生儿先天性“甲低”，用甲状腺激素的替代治疗可防止大脑的发育不良。

1．新生儿促甲状腺激素酶联免疫测定法（Neonatal hTSH EIA）是一种固相双位点酶免疫测定法，滤纸片上干燥血标本洗提出hTSH，同时与包被在酶标板上抗hTSH的单克隆分子和辣根过氧化物酶标记的抗hTSH亚单位的第二抗体结合。

2．过剩的酶结合物和未结合的hTSH被洗涤去掉，加入四甲基联苯胺（TMB）底物溶液进行酶反应。

3．加入1N硫酸（H₂SO₄）溶液终止酶反应，用酶标读数仪在450nm下测定吸光度值。

试剂盒贮存在+2—+8℃。

不要使用过期试剂。

试剂盒使用前，所有试剂及酶标板放置+18—+25℃平衡30分钟。

TMB底物是光敏感性的，应避免光照。

所有试剂组份一旦开启，密封袋或盖子紧紧密封。

1    抗-hTSH包被的反应板                           10块（12×8孔）

2    辣根过氧化物酶标记的抗-hTSH酶结合物（浓缩100X）   2.5ml

3    酶结合物稀释液                                     250ml

4a   TMB显色剂(25X)                                9.5ml

4b   底物缓冲液                                     250ml

5    洗涤液（浓缩10X）                             220ml

6    hTSH标准品                                    1张5套，每套6个标准品，用锡箔袋包装。

每批标准品的数值是不相同的，每套试剂盒内都有确切的数值。

7    hTSH质控 C1-C2                       1张5套，含2个质控，用锡箔袋包装。

每批质控的数值是不相同的，每套试剂盒内都有确切的数值。

8 终止液 0.45M 硫酸

     酶标反应板的塑料粘胶贴                         10张

     质控和标准品的TSH数值表                       1张

 

 

 

 

 

 

表1      试剂的准备

试剂	准备	开启或稀释后的稳定性（+2—+8℃）
1    抗-hTSH包被的反应板	直接使用	2个月
2    辣根过氧化物酶标记的抗-hTSH酶结合物（浓缩）	临用前，用酶结合物稀释液按1：100（1+99）稀释配制。（见表2）	5个月 废弃未用完的酶结合物溶液
3    酶结合物稀释液	供配制酶结合物溶液用	10个月
4    底物溶液	临用前，用底物缓冲液（4b）按1：25（1+24）将TMB显色剂（4a）稀释成底物溶液。	废弃未用完的底物溶液
4a   TMB显色剂	直接供配制底物溶液用	6个月
4b   底物缓冲液	直接供配制底物溶液用	6个月
5    洗涤液（浓缩）	用蒸馏水按1：10（1+9）稀释	6个月 废弃有浑浊的洗涤液
6    hTSH标准品	直接使用	3个月
7           hTSH质控 8           终止液	直接使用 直接使用	3个月 6个月

 

表2酶结合物和底物溶液的准备配制

酶标板数（块）	酶结合物（2） （ml）	酶结合物稀释液（3）（ml）	TMB-显色剂（4a）（ml）	底物缓冲液（4b）（ml）
1	0.24	24	1	24
2	0.42	42	2	48
3	0.62	62	3	72
4	0.82	82	4	96
5	1.00	100	5	120
6	1.20	120	6	144
7	1.38	138	7	168
8	1.58	158	8	192
9	1.76	176	9	216
10	2.00	200	10	240

 

蒸馏水；量筒；试剂瓶；加样枪；吸水纸；计时器；橡胶手套

—酶标读数仪  如芬兰Labsystems Multiskan

—板的振荡器  如芬兰Labsystems iEMS Incubator/Shaker

—洗板机      如芬兰Labsystems Multiwash

—8-道加液器（50—300μl）

—（3mm）打孔器

 

     婴儿出生后3—5天，用滤纸从婴儿的足跟取一滴血液，获得带血点（直径0.8cm）的滤纸片，并确信滤纸片被血样完全浸透，带血样的滤纸片至少晾干2小时，带血样的干燥滤纸片（密封）在+4--+8℃至少可贮存4个月时间。

     滤纸片标本的收集一定是单一的一滴血液，否则会造成假阳性结果。这一滴血在滤纸片上扩展的面积要足够大，保证血液从滤纸的上面均匀浸透到下面，浸透不完全会造成测定的TSH量偏低。采血点应稍微靠近足跟的左表面皮肤，最好抹掉第一滴血，用随后形成的血滴。为提高婴儿足跟针刺点血流，婴儿足跟可用热的（约42℃）湿毛巾敷3分钟。不要过分挤压足部，否则会导致溶血或组织液的稀释。一滴血形成后，用滤纸片轻轻地接触血滴，但不要向足跟挤压，从滤纸背面观察血滴透过滤纸。

     一般一个婴儿要收集三个血点（三滴血）的滤纸标本，血样点应避免污染。置滤纸于水平位置，室温空气干燥2至6小时。注意不要加热，不要堆积，不要接触其他物品表面。将每个带血标本的滤纸片置于一个信封中，并邮寄到新生儿筛查中心实验室。实验室收到标本应放置+4--+8℃防湿保存，并及时筛查。

     标本收集卡应注明以下内容：医院名称，编号，婴儿姓名，出生  年  月  日，住院号，家庭地址，电话和采血日期。

     标准品，对照虽然已经灭活，但不能绝对认为无传染性，应认为有潜在的传染可能。标本等的处理按生物安全二级水平处理。详见美国疾病控制中心国立健康研究所的“微生物和生物医学实验室生物安全”手册。（1984）

 

第一步	用打孔器在滤纸上打下3mm直径的标准品，质控和标本，并依次放置到包被板孔内。
第二步	用酶标记抗体稀释液将酶标记抗体按1：100倍稀释，每孔加入200μl。 室温振动（650rpm）孵育2小时 或室温振动（650rpm）15分钟后，+4℃不振动过夜。
第三步	去掉标本的滤纸片，洗涤液洗涤4次，每次加入300ul。
第四步	加入200μl的底物溶液 室温避光孵育15分钟
第五步	加入100μl1N终止液 在波长450nm下测定吸光度值。

 

检测前，把所有的试剂和酶标反应板放置室温+20--+25℃预热30分钟。

1.用打孔器在滤纸上打下3mm直径的标准品（双孔），质控（双孔）和标本（每孔1片），并依次放置到抗-hTSH包被的酶标板孔内。

注意：围绕血样点中央对称地打孔。

2.用酶标抗体稀释液将酶标抗体按1：100倍稀释，每孔加入200μl酶结合物溶液。

3.孵育

A：室温（不超过+30℃）振动（650rpm）孵育2小时。（贴上粘纸）

B：室温振动15分钟后，+4℃不振动过夜。（贴上粘纸）

注意：当室温>+30℃时，应选择过程B。

4.倒去溶液和吸去滤纸片。

5.洗涤

——手工洗涤

每孔加入300μl的洗涤液（试剂5）；

倒去，拍尽液体；

重复操作4次；

4次洗涤后，轻轻倒拍几次酶标板，倒放在纸巾上一会儿，吸尽残液。

——机器洗涤

洗涤液每孔400μl，重复洗涤4次。

6.每孔加入200μl的底物溶液（试剂4a＋4b）。

7.室温 (不超过+30℃)避光孵育30分钟。（若室温高于+30℃，则避光孵育15分钟。）

8.每孔加入100μl1N终止液。

9.在450nm波长下测定各孔的吸光度值。

绘制标准曲线，纵坐标为吸光度，横坐标为标准品的浓度，从标准曲线上读取质控和标本的浓度。

 

 

 

每批试剂盒的每套试剂盒内都要一张单独纸片，给出质控的期望值，只有质控测定值在期望值范围内，结果才能被接受。

对于正常的和假定的阳性之间的区别，是根据一个预定的临界值。临界值是根据给定的正常人口hTSH值的参考范围，凭经验设定的，高于或接近临界值的标本建议复试。

敏感性 最小浓度为0.9mIU/L

精确性

批内分析

批内分析不精确度

 

批间分析

批间分析不精确度

 

其他脑垂体激素和人绒毛膜促性腺激素干扰实验

LH FSH HCG 干扰实验检测 在含10 mIU/LTSH血清中加入一定数量的每种激素。

 

在浓度为0.05-10g/l,无干扰现象。

准确性

用CDC质控标本检测

 

labsystems公司的临床评估分别在两个不同的实验室。在上海新华医院随机抽查 10780名新生儿进行筛查。样品从刚刚出生三天的小孩采集。正常健康的婴儿和甲低阳性的婴儿浓度分布模式图如下：

 

10780份新生儿样品检测分布图，预定的临界值设置为10 mIU/L。此预定值重测率仅为0.41%。

 

 

低吸收值并且标准曲线很

高本底

低精密性

 

1.仔细阅读试剂盒使用说明书。

2.开始检测前，把试剂盒内所有的试剂及酶标板放置+20--+25℃平衡30分钟。

3.不要使用超过有效期的试剂，不要互用不同批号的试剂，因为每批号试剂的标准品和质控值有可能不同，注意标准品和质控的单位，分清是血清还是全血。

4.建议每块板都使用标准品和对照。

5.检测一旦开始，随后的步骤应连续地进行下去，不要中断。

6.严格操作，方能获得理想的检测结果。应准确地使用加液器，不要使加液头子接触孔壁，避免孔间污染；配制底物溶液等时，所用的器具必须是洁净的，仔细地洗板是很重要的。

7.孵育时间的轻微变化是许可的,2小时±10分钟，20分钟±5分钟。

8.TMB显色剂必须在临用前配制，TMB显色剂是溶解在二甲基亚砜中的，二甲基亚砜对眼睛和皮肤有刺激，万一接触眼睛应立即用清水冲洗，然后去医院治疗；接触皮肤后应立即用大量清水冲洗；操作应带手套；氧化剂，金属离子和肥皂残留物均能干扰TMB的反应。TMB的熔点是18℃，低于此温度，易结晶，使用前应放置+18--+25℃平衡溶解后用底物缓冲液稀释配制。TMB显色剂是光敏感性的，避免暴露在强光下。

9.清洗玻璃容器时，用1N的酸（HCL和H₂SO₄）彻底洗涤，然后用蒸馏水洗涤及遍。

10.     结果一定要以吸光度来判断，不能凭目测判断。

11.     本试剂盒应贮存于+2--+8℃。