Western Blot过程中常见的问题及可能原因分析
Western Blot过程中常见的问题及可能原因分析
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问题 |
可能原因 |
验证或解决办法 |
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背景高 |
膜没有完全均匀湿透 |
使用100% 甲醇浸透膜5-10min |
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洗膜不充分 |
增加洗液体积和洗涤次数 | |
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阻断不充分 |
增加封闭液孵育时间，或者提高温度。选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉，BSA，酪蛋白等） | |
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二抗浓度过高 |
降低二抗浓度 | |
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检测过程中膜干燥 |
保证充分的反应液，避免出现干膜现象 | |
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曝光过度 |
缩短曝光时间 | |
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抗体与阻断蛋白有交叉反应 |
检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应 | |
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没有阳性条带，或者阳性条带比较弱 |
抗体染色不充分 |
增加抗体浓度，延长孵育时间 |
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酶失活 |
直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物 | |
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标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 |
设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。 | |
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试剂不匹配 |
一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性 | |
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一抗失效 |
选择在有效期内抗体；并选择现配现用的工作液 | |
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HRP抑制剂 |
所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠 | |
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膜没有完全均匀湿透 |
使用100%甲醇浸透膜 | |
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靶蛋白分子量小于10Kd |
选择小孔径的膜，缩短转移时间 | |
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甲醇浓度过高 |
过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替 | |
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转移时间不够 |
对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间 | |
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抗体染色不充分 |
增加抗体浓度，延长孵育时间 | |
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标本中靶蛋白含量太低 |
增加标本上样量。 | |
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HRP抑制剂 |
所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠 | |
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抗体活性降低 |
选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置 | |
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封闭过度 |
减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型 | |
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曝光时间过短 |
延长曝光时间 | |
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条带位置不对；或有非特异性条带
色带） |
二抗的非特异性结合 |
增加一个对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的） |
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一抗的特异性不够 |
使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性 | |
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蛋白降解 |
使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂 | |
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二聚体或多聚体存在 |
增加蛋白质变性过程及强度 | |
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抗体浓度过高 |
降低抗体（一抗、二抗）浓度，可以减少非特异性条带 | |
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蛋白上样量过大 |
降低上样量 | |
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封闭剂中有聚集体 |
使用前过滤封闭试剂 | |
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HRP耦联二抗中有聚集体 |
过滤二抗试剂，去除聚集体 | |
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HRP含量过高 |
降低酶联二抗的浓度 |
