一种利用表面等离子共振定量流感病毒的新方法—单向放射免疫扩散法

译自= A novel assay for lnfluenza virus quantification using surfece plasman resanance. Vaccine 2010 Jan8:28(3)759-65

C. Estmer Nilsson 1, S.Abbas1, M.Bennem 1,

A.Lorssan 2, M.D. Hamalalnen 2, A. Frostell Karlssan 2

1 GE Heathcare BioScience AB, Bjorkgatan 30, SE-751 84 Uppsata,Sweden

2 GE Heathcare BioScience AB. Rapsgatan 23. SE-751 84 Uppsata Sweden

 

    利用单向放射免疫扩散法(SRID)来定量血细胞凝集素(HA)，是确保季节性流感疫苗的产品效力的主要方法。本文介绍了一种利用生物传感器技术定量流感病毒的新方法。此方法通过将HlNl、H3N2和B型病毒的HA蛋白固定在传感器芯片上，以抑制性分析的形式来定量病毒。初步结粟显示这种分析与SEID相比，具有具有更高的灵敏度(检测范围0.5—10 ug/ml)和更高的精确度，并且能显著降低了分析及手工操作时间。

 

    流感病毒疫苗的接种是降低季节性流感死亡率的基本策略。在开发和生产过程中流感疫苗的抗原含量主要是利用免疫化学法定量血细胞凝集素(HA)来确定的。单向放射免疫扩散法(SRID)其中最常用也是最重要的方法。自1978年以来，美国食品药品监督管理局(FDA)批准的所有人灭活流感病毒疫苗的效力加的效力都是用SRID来确定的。同时，它还是世界卫生组织(WHO)和欧洲药品管理局(EMEA)的推荐方法[1-3]。然而，除了非常耗费劳力，这种方法还有一些其它缺陷，如准确性低、精确度和灵敏度也低[4]。

 

    到目前为止，流感疫苗主要是利用鸡胚来生产的。然而，对流感病毒新近爆发的恐慌让人们着手利用细胞门着手利用细胞培养来更有效地生产疫苗。这种工艺开发急需新的灵敏而简单的分析工具。

 

    目前已有多种不同的针对流感病毒的定量和检测方法见诸报道：酶联免疫吸附分析(ELISA)[5-7]。神经氨酸酶(NA)活性分析[8,9]，HPLC法[10-12]，血凝分析[11,13]，以及定

量PCR(qPCR)[14-16]。其中一些方法与SRID相比，灵敏度有所提高。然而，除了多重定PCR，这些方法都不能减少手工操作时间，也不能在单个实验中同时定量三种不同亚型的HA。然而，鉴于qPCR必须经过将RNA转化成DNA的反转录步骤，因而相比起定量qPCR更适合用于流感病毒及分型上。Williams等[17]展示了一种液相色谱串联质谱技术联合同位素稀释，用于病毒蛋白的绝对定量。此方法的优势在子能在一个实验中分析三价疫苗，而且降低了对参照抗原和血清的需求量。然而，由于确定HA浓度的独立参考标准无法得到，也就无法与SRID测定进行直撞的比较。此外，这个方法还需要在分析前制备样品[17]。

 

    过去也有利用表面等离子共振(SPR)来检测并定量流感病毒的报道，这些全是基于直接的结合方法[18-25]。这些研究要么测定HA与它的唾液酸受体结合的动力学[20,22]，要么测定抗体与HA和NA的亲和力[18,19,21]。或者描述HA的RNA适体（aptamer）筛选[23]。其中一篇报道介绍了在处理样品和疫苗中定量流感病毒的方法[25]。这种方法利用唾液酸型化台物作为多种病毒株通用的弱亲和力配体，分析范围在10-100 ug/ml。它利用了持续的弱亲和力生物传感方法来避免了再生的需要，并减少了分析时间[25]。小型化的生物传感器也经过

    禽流感病毒检测的测试，特定抗原的检测极限在5 ug/ml[26]。尽管这些基于SPR的方法缩短了手工操作时间，但它们并不比SRID更灵敏，也无法同时分析三种病毒株。

    在此我们介绍一种新方法，利用表面等离子共振以抑制分析的形式准确定量流感病毒。重组的HA蛋白[27](分别为A/H1N1,A/H3N2和B)固定在传感器芯片的葡聚糖基质上，随后让病毒抗原和血滴混合液中针对三种流感类型特异的游离抗体与表面的HA蛋白结合，产生响应的变化(图1)。样品中病毒浓度越高，残余抗体结合响应就越低。重组HA蛋白固定在同一块芯片表面的三个不同流动槽内，这样就能在同一实验中分析三价疫苗。研究表明生物传感器分析是可靠的．与SRID相比回收率、精确度和灵敏度更高，而分析时间更短。校准曲线范田是0.5-10 ug/ml,所有三种亚型(A/H3N2、AHlNl和B)的检测极限预计低子0.5 ug/ml。由于此方法中的参照抗原和血清与当前疫苗效力检测方法中所使用的相同。这种新方法有可能取代或者补充SRID，成为未来的流感疫苗的定量方法。

 

    材料和方法

    对照血清(绵羊)和病毒抗原购自英国NIBSC，除了B/Brisbane/3/2007血清和抗原来自荷兰Solvay Phormaceuticols，PR/B/34血清(鸡)和病毒是购自美国Charles River Laboratories。重组的全长HA蛋白(A/H1N1/New Caledonia/2O/99、A/H3N2/Wyaming/3/2003和B/Jilin/20/2003)分别购自以色列PraspecBio、荷兰Genway和美国Protein Sciences。表4中分析的工艺样品来自瑞典通用电气医疗集团，除了B/Brisbane/3/2007 MBV和TBV)样品以及A/H1N1/Salamon Islands/3/200 TBV样品是由荷兰Solvay Pharmaceuticals提供的。三价疫苗购自三家制造商。覆面活性剂P2O(polyoxyethglenesorbitan)、HBS-EP+缓冲液(10 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05％表面活性剂P2O)、氨基偶联试剂盒、Cy3-染料、琼脂糖和DNA均来自通用电气医疗集团。牛血清白蛋白(BSA)购自Pierce，DMEM购自Invitrogen，蔗糖、NaCl和两性洗涤剂Zwittergent购自默克。

 

    所有分析都使用了Biacore TM l00系统和CMS传感器芯片(通用电气医疗集团)。相互作用研究是基于金表面的表面等离子共振检测，再结合处理试剂的微流体系统。生物分子之间的相互作用以非标记分析形式实时监控。相互作用分子中的一方固定在传感器表面的半流体葡聚糖基质上。另一个分子随后注入到流经传感器表面的溶液中。当注入样品中的分子与固定在传感器表面的相互作用配体结合时，即可检测到SPR响应的变化。响应水平的变化与表面上质量的变化成正比。此方法设定为抑制分析(图1)，以避免大的病毒分子的扩散影响[28]。样品无需预处理就能分析。HBS-EP+作为分析缓冲液。采用标准的胺偶联步骤[29]，注入50-80 ul重组HA(10 ug/ml)从而将重组HA蛋白固定在7000-10000个响应单位(RU)，条件分别为l0 mM马来酸缓冲液(含0.05％Surfactant P2O,pH 6.5)(HA/H1Nl l5分钟,HA/H3N2 7分钟),或者在10 mM磷酸缓冲液(含0.05％Surfactant P2O,pH 7.0)。(HA/B 20分钟)。

 

    对抗流感血清进行滴定，以在400s注射时间内在各自对应的表面上产生700-l400个RU的响应。将病毒参照抗原混合物，或未知浓度的病度样品，与固定稀释度的抗流感血清混合，在400s内注入表面。随后利用50 mM HCl、或者0.05％Surfactant P2O再生表面(30s)。注射样品中的游离抗体与表面的HA结合。产生响应(图1)。每次分析时先进行5-10次只有血清和再生步骤的启动循环，以稳定表面。在每次分析开始、中间和结束时均分析血清和参照抗原的校准曲线。为了在分析过程中根据校准曲线的改变而调整，将三个校准曲线中的四个参数回归的换算系数用于生物传感器软件的原型功能性的标准化。因此每个样品得到一组独特的校准曲线系数，用于样品浓度的计算。

 

    在微滴定板中制备标准品和样品，样品体积40-80 ul，分析一股以无人值守的模式过夜运行(96个样品/标准品约15个小时)。

    可靠性测试所使用的添加剂为DNA、BSA、DMEM、蔗糖和NaCl，如表3所示。

    在三价分析中，HAA/H1Nl、A/H3N2和B固定在同一块芯片的三个不同通道中(图7)。首先将三个特定的参照抗原与血清(A/H1N1/Solomo Islands、A/H3N2/Wiscansin、B/Malaysia)混合，以形成三价的校准曲线抗原和三价血清。样品随后穿过三个表面，在一个实验中同时分析三个毒株。

按照制造商所提供的SRID滴度按比例稀释血清亚型特异性研究，以评估血清亲和力的差异。

 

 

表1 计算浓度和变异系数，以分析B/jiangsu/10/2005(图3)

   

    血清以Cy3-染料标记。未标记的血清和Cy3-标记的血清（小于总血清量的0.5％；证实不会干扰沉淀)与熔化的琼脂糖混合，浇铸在模中，以形成凝胶中的孔。样品和参照抗原在加入凝胶孔之前，用1％的两性洗涤剂Zwittergent在-22处理30分钟。凝胶在-22 15-18个小时，随后干燥，并在Typhoon的450nm下扫尾。利用ImageQuant TL软件将样品的环状区与参照抗原比较，从而进行评估。仪器和软件皆来自通用电气医疗集团。

 

    图2分别显示了三个分析(B、H3N2和HlNl)的典型校准曲线。校准曲线的动态范围优化到0.5-10 ug/ml产生的回收率在98-102%。根据参照抗原的连续稀释(低至0 ug/ml)，所有三种亚型的检测极限预计低于0.5 ug/ml，定量极限约1ug/ml。图1显示了在重组HA表面上重复注射不同浓度（0.5-16 ug/ml)的B/Jiongsu/10/2005血清和抗原后的相对响应。计算出的浓度显示在表1。

 

    曾提到响应会随时间而降低，这在最初10-20个循环中最大，之后随循环数增加而稳定。所有待测的参照抗原在个自的表面也检测到类似的结果，改变再生条件或者用去污剂预处理样品也不会对其产生影响(数据未显示)。为了增加分析的准确性，运行了三个校准曲线，样品浓度是由差值校准曲线来确定的，如第2部分所示。

 

    为了研究针对不同毒株的血清与表面上重组HA蛋白之间相互作用的特异性，在所有三个表面上分析了不同毒株的抗血清(图4)。血清在参照抗原(2 ug/ml)和无参照抗原下进行检测，以确认反应是相应病毒所特异的，以及病毒本身不会产生非特异的背景影响。结果表明固定在表面的三种重组HA蛋白分别是三类亚型A/H1N1、A/H3N2和B血清所特异的，而对于同亚型病毒内的毒株之间则是通用的。所有血清中只有一种能与所有表面结合(鸡/H1N1/PR/8/34血清，数据末显示)。其中的原因目前未知。可能是鸡来源的成分引起了非特异响应，而其它血清都来自绵羊。

 

    为了扩展特异性研究，对27种不同的血清与固定了HA/H3N2的表面之间的结合进行分析(图5、表2)。结果显示只有特异针对H3N2亚型的血清才能与表面明显结合。抗-B和抗-H1N1血清显示出低的结合水平。相应地，利用50 mM HCl、0.05％ P2O再生后，也开展了27种血清与固定了HA/B和HA/H1N1的表面结合的实验。结果显示只有抗-B和抗-H1Nl血清分别明显结合(数据未显示)。

 

 

 

    图5 27种不同血清(表2中详细说明)在固定了重组HA/H3N2的传感器芯片上的响应。A/H3N2血清毒株的结合以实心菱形标出，A/H1N1血清毒株以空心菱形标出，B毒株以空心正方形标出。用50 mM HCl和0.05％ P2O再生表面。血清1和2重复分析两次，以监测响应偏差。

    开展初步分析以探索毒株特异性。在固定了重组HAA/H3N2/Wyoming的传感器芯片上运行校准曲线，该曲线有着标准品和血清的四个可能组合，针对随机选择的H3N2毒株Wyoming和New York(图6A)。最低浓度的响应水平范围在1700-2000个RU。为了利于比较，将各个曲线的每个响应除以最低浓度(以％表示)，来标准化响应。曲线以N.Y/N.Y、N.Y/W、W/W和W/N.Y的顺序运行。W/W组合在另一块有着相似固定水平的芯片上重复运行4次，提供实验差异的参考数据(图6B)。结果显示所有W/W组合的抑制实现了最高的灵敏度。结果还表明，就这两个毒株而言，如果用New York标准品和血清来定量Wyoming样品，合获得过高的计算浓度值。

 

    在疫苗纯化过程中，各个步骤的样品有着不同的纯化图，可能会含有影响浓度分析的化合物。为了研究分析中添加剂的影响，分析前在参照抗原中加入了BSA、-DNA、细胞培养基、蔗糖和盐。结祟显示在表3。BSA、-DNA和细胞培养基不影响分析。盐和蔗糖降低了响应，显著增加了表观浓度：然而这些添加剂的影响可用稀释处理来避免。研究发现1<％的蔗糖和<0.2 M的NaCl对于可靠定量是理想的。还重复运行了含有55 ug/ml纯化的A/H1N1/Solomon slond的对照样品，以研究准确性。在一个分析(一块芯片/凝胶)内，生物传感器方法的内部CV为2％(5次重复)，而SRID为9％(12次重复)。两个操作员在不同时间所做的不同分析之间，生物传感器方法的内部CV为5％(3次分析)，而SRID为18％(5次分析)。

 

    为了测试生物传感器方法的性能，对流感疫苗纯化过程中不同阶段的样品进行了分析，从收集的细胞培养上清到过滤终产物。同一个样品还用SRID分析以进行比较。结果汇总见表4。样品经过稀释，这样一般每个样品的两次稀释能达到标准曲线范围内的浓度。每个样品重复两次，并计算出每次稀释的变异系数(CV)。对于大部分样品，两种方法的结果有着良好的一致性，但生物传感器测定与SRID相比，两次重复之间的CV要低得多且灵敏度更高。对于少数HA浓度高(>100 ug/ml)的样品，线性稀释很难实现。不过，这是生物传感器和SRID两种方法都有的，因此可认为源于样品，而不是稀释本身。

 

 

    Biocore T100可将样品连续注射在四个流动槽中，每个流动槽有着独立的传感器表面。为了在同一个实验中分析三价疫苗，三个流动槽的传感器表面分别固定了HAA/H1Nl、A/H3N2和B。利用参照抗原和特异抗血清的三价混合物对来自三家制造商的疫苗进行分析(图7)。疫苗同时用SRID分析(在三块不同的凝胶上)。SRID和生物传感器方法的测定仍然很相似，且生物传感器方法的重复实验精确度更高。生物传感器方法的总分析时间为9小时，手工操作为1-2小时。而SRID分析的总时间为22个小时，手工操作为6-8小时。

 

 

 

 

 

 

    在本文中，我们展示了一种新颖的定量HA的生物传感器方法的开发和初步结果，它利用了与SRID方法相同的参照抗原和血清，再加上固定的HA。

 

    来自不同供应商的重组HA蛋白经过固定化的测试，并根据固定性质(如活性和直接稀释到固定缓冲液的高浓度)进行挑选(数据未显示)。挑选出的蛋白可利用标准的氨基偶联步骤，在接近中性(pH 6.5-7.0)的缓冲液中轻松地进行固定化。其它蛋白固定化试剂，如通过活性二硫化物[29]或蛋白上引入的醛基来偶联，也能产生活性表面，只是随时间的稳定性比胺偶联方法所获得的稍逊(数据未显示)。除了利用表面上的重组HA，初步研究显示单价疫苗(MBV)，特别是亚基或裂解疫苗，也可以固定并得到相似的定量结果(数据在别处显示)。MBV可能成为表面物质的更可靠来源，因为疫苗制造商会在年度生产中确保其供应量。

 

    用较早期的血清来获得初步定量的可能性。亚型特异性分析结果以及定量的高度准确性(或许这更为重要)  (图3，表1和4)表明再生不会分析性能产生负面影响。利用这种再生，经历>100次样品/标准品处理也依然可以保持其对所有三种亚型足够的结合活性从而进行可靠地定量。表面活性剂P2O(Tween 20)包含在所有溶液中，因为已知它能在不影响相互作用分析的前提下防止蛋白吸附在流动系统中，从而使原始样品得以进行分析。而且，研究表明非离子型去污剂的添加有助于防止HA聚集[33]。针对H3N2利用两个随机选择的毒株(New York和Wyoming)来简单研究其毒株特异性。正如由遗传差异所得预期，两种血清和参照抗原对另一毒株表现出不同的结合模式(图6)。当抗原和血清都是Wyoming时，此组合所获得的灵敏度最高。这反映出这些试剂比NewYork试剂具更高的亲和，从而导致对表面结合产生更有效的抑制，而不是因为固定的HA是Wyoming。采用与分析样品毒株不同的参照抗原和血清，可获得不同的绝对浓度。不过，工艺开发中产量的比较并不一定需要绝对浓度。可以通过进一步研究来探索毒株间的遗传相近性所决定的这种差异的相关性。蔗糖(>1％)和氯化钠(>0.2 M)在可靠性测试中确实干扰了所测量到的响应。蔗糖和盐浓度升高，响应降低(使HA浓度计算值增加)。已知在超出生理条件下盐浓度的增加会削弱抗体与抗原的结合。在疫苗纯化过程中，常使用蔗糖梯度和层析柱，获得蔗糖>40%、NaCl>0.5 M的样品，然而由于这些样品中的病毒浓度也很高(>200 ug/ml)，因此可通过稀释过程来避免这种附加效应。季节性流感疫苗应当富有三种不同的流感病毒株(H1N1、A/H3H2和B)的每种各15 ug的血细胞凝集素。为了用SRID方法来分析三价季节性流感疫苗半成品和最终产品，疫苗制造商必须进行三次单独的分析。有了生物传感器方法，就能够在单个实验中定量疫苗中的三种不同毒株(图7)，让三价疫苗的批次放行更加有效。此外，与SRID相比，生物传感器方法显示出更高的回收率和测量精确度。精确度更高，将有可能减免过高疫苗剂量的需要。

 

    综上所述，本文展示的初期数据表明，与SRID相比，生物传感器方法具有高准确性及更高的灵敏度和精确度，同时可显著减少的分析和手工操作时间。将这种方法扩展到固定化亚基、裂解甚至整个病毒疫苗的形式，将会开创定量方法的更广泛应用，包括表位定位和动力学分析等基础研究。