miRNA qPCR Detection Primer Set（miRNA检测试剂盒）实验说明
一、概述
1、介绍
microRNA(miRNA)是一类有大约22 个核苷酸组成的非编码小分子RNA，其广泛存在于真核生物中。miRNA 在个体发育的不同时期及不同组织中有不同的表达模式，都表明了其在发育和分化中起有重大的调控作用。迄今为此，对miRNA 的检测方法主要有Northern Blot 等基于分子杂交的方法，这些方法敏感度低、耗时长、RNA 的用量较大。miRNA Q-PCR etection Kit采用了国际上公认的核酸检测标准技术――Real-Time PCR 技术来对miRNA 进行检测，其具有快速、特异性强、灵敏度高等优点。
2、实验原理
EzOmicsTM miRNA qPCR Detection Primer Set包含了miRNA特异的逆转录引物，以及qPCR正、反向引物套装。其中茎凸环结构状的miRNA特异逆转录引物可特异性的转录成熟的miRNA。再利用高度特异的正反向引物，使miRNA定量即灵敏又高度特异。
EzOmicsTM miRNA qPCR Detection Primer Set提供了一种最低能检测到5个拷贝目标miRNA的高灵敏度的检测方法，并且具有一个7 个数量级的动态变化范围，反应的模板可以是总RNA或者已纯化的小RNA等。
3、产品内容
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名称 |
介绍 |
量 |
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RT Primer |
miRNA Reverse Transcription Primer |
2 nmol |
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Forward Primer |
miRNA Forward Primer |
2 nmol |
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Revers Primer |
Universal Reverse Primer |
2 nmol |
二、实验准备
1、客户需自己提供实验试剂
一步法或两步法qPCR mix，反转录酶，RNA 酶抑制剂，DEPC-H2O 等
2、耗材准备
无RNase，DNase 的吸头，离心管等
3、引物准备
引物为干粉形式，需先离心，后每管加入200 μL DEPC-H2O稀
释至10μM，混匀后于-20oC冻存备用
4、仪器准备
离心机、实时荧光定量PCR 仪等
三、实验步骤
1．两步法扩增
先将miRNA做反转录miRNA cDNA，然后再进行qPCR定量
1.1 RT Primer Mix的配置
EzOmicsTM miRNA qPCR Detection Primer Set可以同时检测50个以内的miRNA分子。反转录之前，需预先配置RT Primer Mix(200nM)。如果需要用5S rRNA 或U6 snRNA 做内参对照，需同时配置Random Primer或内参的Reverse Prime做反转录引物。
1.2 逆转录体系
| 试剂 | 体积 | 终浓度 |
| RNA模板 | 0.2ng~1μg | 根据实验需求 |
| RT Primer Mix | 5 μl | 20nM |
| 10×RT Buffer | 5 μl | 1× |
| RNase inhibitor | 见试剂供应商说明书 | |
| dNTP (2.5mM) | 4 μl | 200nM |
| 逆转录酶 | 见试剂供应商说明书 | |
| DEPC-H2O | 补足至50μl |
1.3 逆转录程序
反应完成后，将miRNA cDNA存放于-20℃（长期保存请分装保
存于-80℃）。
1.4 miRNA实时定量 PCR反应体系
1.5 实时定量 PCR反应程序
2．一步法扩增：
将miRNA反转录和qPCR定量两个过程放在一个管子中进行
2.1 一步法miRNA定量体系的建立
2.2 实时定量 PCR反应程序
