人衰老成纤维细胞经紫外线损伤后的DNA 修复和细胞周期调控
人衰老成纤维细胞经紫外线损伤后的DNA 修复和细胞周期调控
段建明 张宗玉 童坦君
(北京医科大学生物化学与分子生物学系, 北京 100083)
摘要 以体外培养的不同代龄的人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS) 为对象, 紫外线诱导DNA 损伤后, 观察细胞形态、增殖特性、细胞周期、DNA修复变化等细胞应答以及gadd153、p21、p53 等基因的转录水平的表达变化. 结果显示: 紫外线诱导DNA损伤后, 衰老(>55代) 2BS 细胞形
态及增殖能力的改变不如年轻细胞(<30代) 显著; 不同代龄的细胞损伤后均出现G1 期阻滞现象, 年轻细胞G1 期阻滞率明显高于衰老细胞(P<0105) ; 衰老细胞总的修复能力较年轻细胞明显下降(P<0101) ; 同时, gadd153、p21、p53 等的可诱导性均低于年轻2BS 细胞. 由此, 分别在细胞水平与基因水平反映了衰老细胞经紫外线照射损伤后的细胞应答变化与修复机能减退的关系.
关键词 衰老细胞,DNA 损伤修复, 细胞周期, 检验点控制
DNA 损伤的积累及修复能力的下降是生物衰老的重要原因之一[1]. p53、p21 和ATM 是近年发现的人类细胞3个DNA 损伤应答的检验点控制(check2point control) 基因[2]. p53、p21 不仅作为抑癌基因发挥重要作用, 且在DNA 损伤的细胞应答中起中心调控作用, 它们可调节DNA损伤修复、细胞周期阻断以及细胞凋亡等诸多基因的转录[3]. DNA损伤可诱导基因中的gadd45、gadd153与DNA 损伤后的细胞周期阻滞以及修复也密切相关, 可能作为p53的下游基因而起作用[3]. 这些基因在衰老细胞中有无表达变化及与衰老细胞修复能力的下降是否有关? 至今未见国内外报道. 我们以体外培养的人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS)为对象, 研究了紫外线照射后衰老细胞中的DNA 损伤可诱导基因gadd153 以及检验点控制基因p21、p53的表达变化,及其与DNA修复能力和细胞周期变化的相关性.
1 材料与方法
1.1 材料及主要试剂 人胚肺二倍体成纤维细胞引自卫生部生物制品研究所, pB luesSK 质粒(gadd153 cDNA ) 由北京医科大学人民医院惠赠,p21WAF1.CIP1. SDI1cDNA由美国Baylor 医学院惠赠,p53及B2act in cDNA 探针为本室留存. DMEM干粉培养基: GIBCO.BRL公司, 胎牛血清: 北京北郊农场血液制品所, 3H2TdR 及A232P dCTP: 北京亚辉生物工程公司, P rim e2a2Gene Lebeling System:Promege公司, 羟基脲、鲑鱼精DNA、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白: Sigma公司, 其它试剂均为Sig2ma产品或国产分析纯.
1.2 细胞培养 人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS)培养于含10% 胎牛血清的DMEM 培养液中, 37℃温育箱中生长, 传代至62±4 代及24±6 代分别作为衰老及年轻细胞使用.
1.3 细胞形态及增殖特性观察 细胞生长至对数生长期后, 细胞悬液调整至1×104细胞.ml, 移入24孔板中培养, 待细胞贴壁后以紫外线(0145J.m 2.s) 照射5 min 损伤细胞[4],更换新鲜培养液于37℃温育, 每12h观察细胞形态变化并进行细胞计数, 以未进行紫外线照射的衰老及年轻细胞作对照.
1.4 细胞周期分析 紫外线照射剂量、时间同上,37℃温育24h后胰酶消化, 收集细胞, 再用RNA 酶于37℃消化1h, 然后用碘化丙啶(PI)染色, 以Bec2ton2Dickinson 流式细胞仪进行FACScan(fluo res2cence act ivated cell sorting)分析, 以未进行紫外线照射的衰老及年轻细胞作对照。
1.5 UDS (un scheduled DNA syn thes is) 测定 细胞计数后, 以1×105 细胞.孔传于6孔板, 待细胞完全贴壁后,以含015% 胎牛血清的DMEM培养液饥饿细胞72h使细胞同步化,更换含5mmo l.L羟基脲的无血清DMEM 培养液于37℃温育1h后,紫外线照射, 其剂量与时间同上,更换培养液(含5mmo l.L 羟基脲、1LCi.m l3H2TdR、10%胎牛血清的DMEM) , 37℃温育不同时间收集细胞,进行3H2TdR计数, 对照组为未进行紫外线照射的细胞[5]。
1.6 斑点及Northern 印迹杂交细胞处于对数生长期时进行紫外线照射,时间、剂量同上, 然后于37℃温育不同时间收集细胞, 用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA,然后转膜、标记探针及进行斑点和Northern 杂交[6,7] , 以未进行紫外线照射的细胞为对照. 杂交结果由积分光密度扫描分析。
2 结果
2.1 细胞形态及增殖特性的比较 紫外线照射前可见衰老2BS细胞形态与年轻细胞明显不同, 衰老细胞胞体肥大、胞浆内颗粒增多、胞浆混浊、折光性下降、细胞排列极不规则; 而年轻细胞则胞体细长、胞浆清亮、细胞呈漩涡状排列. 紫外线照射后, 衰老细胞形态变化不十分明显, 仅见胞浆内颗粒略显增加; 而年轻细胞则可见胞浆颗粒明显增多、胞浆透明度下降、胞体也略显增大, 但培养约1周后细胞形态基本恢复正常. 紫外线照射前后细胞生长曲线见Fig.1, 经紫外线照射后年轻细胞增殖速率受到明显抑制, 但约6d后增殖能力恢复正常; 衰老细胞增殖速率明显低于年轻细胞, 紫外线照射前后增殖变化不十分明显。
212 细胞周期时相变化 紫外线照射后衰老及年轻的2BS 细胞均可见G1 期阻滞, 而年轻细胞G1 期细胞阻滞率高于较衰老细胞(P<0105) (Fig.2).
213 DNA 修复能力比较 以3H2TdR 参入法测定非程序性DNA 合成(UDS) , 以表示DNA 总修复能力. 从F ig. 3 可见, 在紫外线照射后12 h 左右UDS达峰值. 衰老2BS 细胞的修复能力明显低于年轻细胞(P < 0101).
214 斑点及Northern 印迹杂交结果分析 由斑点杂交结果可见, 紫外线照射6 h 后gadd 153 表达达峰值, 衰老细胞的gadd 153 可诱导性明显低于年轻细胞, 结果见(Fig. 4). 根据斑点杂交结果选取紫外线照射后6 h 收集细胞, 进行Northern 杂交, 结果显示(Fig. 5) , 紫外线照射后衰老细胞中gadd153、p 53、p 21 基因的可诱导性均明显低于年轻细胞, 但其中p 53 诱导性改变最小. 另外, 这三种基因在紫外线损伤前的基本表达在衰老细胞及年轻细胞中也有所不同, 其中p 21 在衰老细胞中的基本表达明显高于年轻细胞, gadd153 的表达在衰老细胞中似略高于年轻细胞, 而p53 的表达差异不显著.
3 讨论
细胞衰老是一个多因素、多途径所致的复杂结果,DNA 损伤的积累及修复能力的下降可能是细胞衰老的重要原因之一[8] , 在DNA 受损后衰老细胞应答与年轻细胞有所不同. 衰老细胞的形态及增殖曲线的改变不明显, 同时其恢复也缓慢. 流式细胞计检测结果显示, 衰老细胞G1 期阻滞率的增加幅度低于年轻细胞; 同时衰老细胞的DNA 修复能力显著低于年轻细胞. 这些结果都说明衰老细胞对于DNA 损伤的应答能力明显不如年轻细胞. 那么, 衰老细胞对DNA 损伤的应答能力下降的根本原因是什么呢? p53、p21 和gaddl53 等基因表达状况在紫外线照射前后的变化可能为我们提供了一些有价值的线索.
DNA 损伤后, 会通过一定的信号传导途径引起细胞反应, 诱导众多基因表达的激活或抑制,DNA 修复系统的激活则是细胞维持自身功能完整性和细胞生存的一个重要机制[ 9 ]. p 53 在DNA损伤监控中处于检验点控制的位置, 起着中枢作用,p21 及gadd153 均为其下游基因, 它们有着部分共同的途径, 又可通过各自不同的途径作用于细胞周期及修复系统, 在DNA 损伤修复基因调控网络中既互相协同又相互影响, 发挥着各自不同的作用[9]. p21是周期蛋白激酶的抑制因子,作为p 53的下游基因, 在p 53与细胞周期调控之间起桥梁作用. p 21的高表达会导致细胞周期阻滞, 还会通过与PCNA (增殖细胞核抗原) 相作用影响DNA 的复制及其修复[3]. gadd153 在紫外线的诱导表达中也是依赖于p53的, 它作为p53 的下游基因,一方面对损伤后的细胞周期有一定影响, 另一方面可能与DNA 损伤修复偶联. 有文献报道, gadd153对转录因子C/EBP (CAAT增强子结合蛋白) 家族有负调控作用[10]. 实验结果显示, 经紫外线损伤后无论年轻及衰老细胞出现的G1 期的阻滞同时伴随着gadd153、p 21、p 53 基因的高表达, 这说明这三种基因的可诱导与细胞周期阻滞有着直接的关系; 然而, 有趣的是衰老细胞在紫外线照射前即存在明显的G1 期阻滞, 此时仅见p 21 的高表达, 这说明p 21对衰老细胞G1 期的阻滞可能起主要作用, 而p21的高表达是因为衰老细胞中存在的损伤累积不能被有效修复所致. 因为衰老细胞本身即存在明显的G1期阻滞, 加之p 53、gadd153, 尤其是p 21 基因的诱导性下降, 可能是衰老细胞G1 期增幅低于年轻细胞的原因. 同时, 衰老细胞修复能力的下降也可能与gadd 基因(包括gadd153, gadd45 等)、p 21 及p 53 等基因的DNA 损伤后的可诱导性在衰老细胞中的下降有关. 实验结果显示, 衰老细胞中虽然p 21 这一细胞周期抑制因子的高表达导致了细胞的G1 期阻滞, 为修复损伤争取了时间, 但其它与修复直接相关的基因却不能有效地表达和发生作用. 实验中还发现, p 53 表达变化并不十分显著, 说明p 21 在衰老细胞中的高表达有可能通过非p 53 途径调控[ 10 ]; 但另一方面这可能与p 53 作用通过磷酸化状态的改变而实现有关[ 11 ] , 在损伤诱导后, p 53 蛋白与各种基因的结合活性可能通过其磷酸化状态的改变而有所改变, 这同样可能是衰老细胞中p 53 未见显著高表达的原因之一. 然而, 这几种基因在衰老细胞中的损伤可诱导性下降却具有一致性, 这可能正是衰老细胞在DNA 损伤后细胞周期调控能力及修复能力下降的根本原因之一. 总之, 探讨衰老细胞在DNA 损伤后细胞周期调控、DNA损伤修复以及DNA 损伤可诱导基因的表达改变, 有助于DNA 损伤修复基因调控网络的阐明, 对于揭示DNA 损伤修复与细胞衰老的关系具有重要的理论意义.
References
1 童坦君, 张宗玉. 医学老年学——衰老与长寿. 北京: 人民卫生出版社, (Tong Tanjun, Zhang Zongyu. M ed ical Gerontology ——Senescence and long ev ity. Beijing: People’s Health P ress) 1995:139～ 142
2 Paulovich A G, Toczysk iD P, Hartwell L H. When checkpoints fail. Cell, 1997, 88: 315～321
3 Scanchez Y, Elledge S J. Stopped fo r repairs. B ioE ssay s, 1995, 17(6) : 545～ 548
4 南新升, 张宗玉, 黄莉, 张昌颍. 衰老过程中大鼠脾细胞DNA 修复能力的变化, 中华老年医学杂志, (N an Xinsheng, ZhangZongyu,Huang L i, Zhang Changying. Change of DNA repair ca2pacity of rat sp leen cells during aging. Ch in J Geriatrics) 1992,11 (5): 301
5 T illey R,M iller S, Srivastava V , Busbee D. Enhanced unsched2uled DNA synthesis by secondary cultures of lung cells estab2lished from calo rically restricted aged rats. Mech Ageing D ev ,1992, 63: 165～ 176
6 王文恭, 童坦君. 细胞凋亡过程中c2erbB22 基因的表达. 中国生物化学与分子生物学报(W angW engong, Tong Tanjun. Theex2pression of c2erbB22 on apoptotic process. Ch in J B iochem M olB iol) , 1998, 14 (3) : 314～ 317
7 王文恭, 童垣君. 小鼠成纤维细胞凋亡过程中p53 与bcl22 表达的时序性. 中国生物化学与分子生物学报(W ang W engong,Tong Tanjun. The time o rder of p53 and bcl22 gene exp ressionin the apop to tic p rocess of mouse fibroblast cell lines. Ch in JB iochem
M ol B iol) , 1998, 14 (3) : 318～ 321
8 Vo jta P J , Barrett J C. Genetic analysis of cellular senescence.B ioch im B iop hy c A cta, 1995, 1242: 29～ 41
9 Sancar A. DNA repair in humans. A nnu R ev Genetics, 1995, 29:69～105
10 Delmastro D A , L i J , V aisman A , So lle M , Chaney S G. DNAdamage inducible gene exp ression fo llow ing p latinum treatmentin human ovarian carcinoma cell lines. Cancer Chem other P har2m acol, 1997, 39: 245～253
11 V aziri H,W estM D,A llwopp R C, Davison T S,W u Y S, A r2row smith C H, Poirier G G, Bench imo l S. A TM 2dependent telomere loss in aging human dip lo id fibroblasts and DNA dam2age lead to the po st2translational activation of p53 protein in2vo lving po ly (ADP2ribose) polymerase. EM BO J , 1997, 16 (19) :6018～6033
