免疫学细胞因子的定量检测，Elispot酶联斑点分析技术
ELISPOT技术原理
在免疫学领域中，对于疾病以及疫苗研究不仅仅局限于体液免疫应答（B细胞免疫），细胞介导的免疫应答(cell mediated immune response，CMI)也是人们所关注的，而T细胞在CMI中起关键作用。在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法（ELISA）检测体液中游离的细胞因子（CK）或抗体，但由于游离的循环抗体或CK的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK的水平。 80 年代，国外的科研工作者根据 ELISA 技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和 CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ ELISPOT ）。作为一项新型的免疫酶技术——酶联免疫斑点法(enzyme linked immunospot assay，ELISPOT)，是从单细胞水平检测分泌抗体细胞(ASC) 或分泌细胞因子(CK) 细胞的一项细胞免疫学检测技术。由于该方法具有较高的特异性和敏感性，易操作，成本相对流式细胞分析术也较低，已被广泛用于分泌CK细胞检测或ASC测定中，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。
ELISPOT 法源自 ELISA，又突破传统 ELISA 法，是定量 ELISA 技术的延伸和新的发展。两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同在于：
（1） ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。
（2） ELISPOT也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT 分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）
由于是单细胞水平检测， ELISPOT 比 ELISA 和有限稀释法等更灵敏，能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。捕获抗体为高亲和力、高特异性、低内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。
下面将从发展、原理、具体实验操作、技术优势和应用几方面进行介绍。
ELISPOT技术的发展
（1） ELISPOT技术的过去
ELISPOT是20多年前便己研发成功的老技术。Czerkinsky 等人率先在1983年，运用该技术成功地检测出因受激而分泌抗体的B细胞频率。从那时起世界各国免疫学者便开始一长期的ELISPOT Cytokine技术竞赛，每个团队都希望能率先将此一技术推广来研究T细胞免疫，其绝妙之处在提供一接近体内实验的环境，藉由侦测T细胞分泌的各类细胞因子，来定量机体内免疫反应启始者Precursor T的clonal size族群大小，同时预测体内免疫系统即将进行的下游免疫反应。
ELISPOT Cytokine技术虽说操作简单，但该技术并没能如预期地很快地被成功应用在ex vivo T细胞功能研究。要让ELISPOT技术从B细胞免疫走向T细胞免疫的产生的第一个主要问题，便是灵敏度的提升，因为T细胞因子较之B细胞免疫球蛋白产量极少。早期ELISPOT的分析条件不是非常理想，成对抗体的品质、呈色底膜的材质等几个技术性的问题，使当时多数研究团队很难获得清晰的斑点，结果是敏感度不够、数据分析重现性低。这问题直到1996美国俄亥俄卅Case Western Reserve大学Paul Lehmann团队引进PVDF薄膜的应用（Forsthuber et al., Science, 1996），才釜底抽薪地解决了该技术因斑点呈色问题造成低敏感度的缺失。与原来的标准膜面相比，PVDF薄膜提供1,000倍的较大面积来吸附单株抗体，使T细胞分泌的各类细胞因子能在细胞周围就近被俘虏，让呈色斑点集中、清晰、对比色高，大大的提高ELISPOT Cytokine分析的敏感度。图一是使用PVDF-BASED改良薄膜（Panel A）与传统标准薄膜（Panel B）并行实验的比较结果。同样的人体 PBMC样品，在通过完全相同的实验，Panel A呈现较清晰的小色点。
第二个技术性问题是ELISPOT Cytokine实验分析的几个基本假设缺乏科学实证，也使得该技术在当时并没受到该有的广泛重视。没有科研人员尝试去厘清一些基础但很重要的问题，诸如：
实验所得的斑点是抗原特定T细胞所生产，还是旁观细胞受Cytokine刺激的次级效应？
斑点的小或大有何生理意义；如何决定cutoff值？
能否相信斑点是由单一的细胞造成？
ELISPOT Cytokine分析技术能准确测量的频率范围？
如果效应相互拮抗的cytokine同时产生，它们是否会互相妨碍？及到什么程度？
（2） ELISPOT 技术的现在
1996年以来随着抗体制备、PVDF膜材篁等技术改良，ELISPOT 分析技术已经逐渐达到科研人员的期待，它已是当世公认最灵敏抗原特定T细胞的体外检测技术。藉由检验新鲜分离PBMC细胞所分泌cytokine的指纹，ELISPOT 分析技术可提示T细胞免疫系统的两个重要参数：抗原特定T细胞的clone族群大小；和免疫效应细胞的信号传导路径Th1/Th2。
多年来经过数十个研究团队的致力研究，对于ELISPOT分析技术本身的几个问题，也有了科学上的验证。目前一般公认，ELISPOT技术允许科研人员在单细胞水平上识别抗原特定T细胞，主要针对经由CD4或者CD8细胞的免疫反应。在适当的实验设计下，ELISPOT Cytokine 斑点的数量分析显示斑点是由一个单细胞所生成，同时斑点形态学与Time Response分析则显示斑点直径大小直接反映该细胞族群的产能。也因为如此，ELISPOT是个免疫学上的标竿技术，它可以允许科研人员在几乎自然生理条件下，观察细胞实际分泌Cytokine的进程，进而可以得到药理学信息，阐明免疫调节药物如何影响T细胞分泌各类cytokine的速率。药物抑制T细胞免疫一般可通过两程截然不同的机转；使能分泌Cytokine的Precursor T细胞族群变小，或减少每Precursor T细胞的cytokine产能，而ELISPOT技术能提供双份信息。
ELISPOT分析技术的几个特点已经让它在抗原特定T细胞免疫学上独占鳌头。此技术是当世唯一准许百万分之一1:1000,000的准确分析，如此强效的解析力使流式细胞技术也望其项背，以目前国内外常规的intracellular cytokine或者Dimer/ tetramer染色，流式技术的灵敏度一般限制在1:10,000。这样的高灵敏度对T细胞免疫学研究是必须的，因为抗原特定T细胞一般在机体周边循环系统发生的频率通常低于万中取一。此外由于ELISPOT Cytokine技术被证实适用于冰冻后复苏的人类淋巴球，解冻后PMBC与新鲜分离样品有相当的效价，没有丧失功能。这一点对临床试验非常重要，它使科研人员得以并行分析免疫治疗前、后的病人血样，如果试验牵涉全国多个临床试验机构，病人血样可冰存并同时集中在「中央实验室」一齐被测试。同理，一个血样或标准对照品可被分装小份，被送到不同检验中心进行测试，以交互比对，同时有利ELISPOT Cytokine技术流程的规范化、标准化。
（3） ELISPOT 未来展望
ELISPOT 分析技术正在欧美各国发挥它的完整潜能，它让免疫学家可以直接洞察活体内T细胞相关生理学或病理学，就像是心脏外科医师手上的那张心电图，经由这个技术科研人员可以在活体内直接进入一个器官系统，在那里视察、发掘，得到全新的智识。
从各国文献可见ELISPOT技术已经达到标准化、规范化的要求，并被广泛地应用在多项领域，包括监视癌症病人接受免疫疗程时的反应(Lewis, 2000 and Janetzki, 2000)，以及感染性疾病(Moss, 2000, Rahman, 2000, Rowland-Jones, 1998, Herr, 1997 and Lechner, 2000)、肿瘤(Nagorsen, 2000)、或自体免疫病人体内的一个特定的免疫反应型式(Pelfrey, 2000)。ELISPOT技术同时也在数个疫苗效价评估人体试验中，被当成重要的终结指针。2003年1月，世界卫生组织通过与大陆北京性艾中心合作，将应用ELISPOT技术来监测HIV疫苗研究免疫应答反应技术，该计划将是首次利用ELISPOT技术对亚洲国家从事HIV疫苗研究和临床试验的有关研究。我们期待未来此技术能在我国免疫学界得到广泛地应用。
原理
ELISPOT就其原理来说实在是很简单的，从本质上说和ELISA的原理是一样的，理解起来并不难。细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT 底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。传统的ELISA与ELISPOT都是根据酶免疫学检测原理，通过酶的高催化频率，放大反应效果，从而达到很高敏感度的检测效果。
ELISPOT全名为Enzyme-linked Immunospot Assay，其技术原理与ELISA相似。其实验设计是在96微孔培养盘底部披覆PVDF薄膜，用来吸附特殊挑选、且无毒性（不含sodium azide、内毒素endotoxin）的单株抗体。静脉血PBMC细胞经适当分离处理后，会被分配到微孔盘上，再接受适当的抗原刺激，并将微孔盘放置于温箱中过夜培养一段时间。一般而言，记忆型T细胞在受抗原刺激数小时后会开始分泌细胞激素，此时局部(在紧靠分泌细胞的周围)分泌出的细胞激素会被PVDF薄膜上特异抗体捕获。微孔盘中的细胞被移除并清洗后，被捕获的细胞激素可进一步使用生物素（Biotin）标记的二次抗体来标志，其后再以结合酵素的StreptAvidin与之作用，并加入酵素受质使其呈色，有反应作用的细胞会留下染色斑点。
反应步骤可大致分为：
（1） 利用特定细胞因子的单克隆抗体包被96孔板，封闭剩余的空白位点；
（2） 加入细胞悬液，用特异性抗原刺激、活化细胞，产生细胞因子，细胞因子会往附近扩散与之前包被的抗体进行特异结合；
（3） 洗掉细胞；
（4） 加入酶标二抗特异与细胞因子进行结合，通过底物的显色反应，一个细胞所在位置就会显出斑点，最后利用显微镜或者特定的读板机（reader）就可以计算出样品中被激活细胞的数目。
以上是检测分泌细胞因子细胞的流程，如果是检测分泌特异抗体的细胞只需把包被特异抗体变为包被特异抗原即可。
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ELISPOT技术实验步骤
从原理上看ELISPOT的确很简单，但是在操作过程中有许多条件需要摸索，所以这里进一步介绍一下ELISPOT的操作步骤。
（1） 将适量捕获性抗体预先包被于96孔ELISPOT板上，用胶带封板并在4℃孵育过夜。将板用PBS洗6遍，再用含体积比10%胎牛血清(FCS)的培养基封闭，室温下孵育至少1h。FCS可以封闭所包被抗体的FCS受体以降低非特异性反应。有一种特殊的96孔板底面介质是PVDF膜，利用膜的多孔结构可以让单个细胞坐到其中，然后分泌细胞因子或特定抗体，这样使最后的检测单个细胞灵敏度成为可能。同时，PVDF膜的不透光性也是ELISPOT与ELISA的不同之处。理论上是可以同时包被两个不同的抗体的，两种不同的抗体可以利用不同的显色系统显出不同颜色，但是这样就要考虑到不同抗体间的不亲和性，必需保证每种抗体包被的数量要足够。如果是使用试剂盒的预包被板，这一步就可以省略啦。
（2） 将阴性对照和细胞样品，如外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，经纯化的CD8+T细胞或去除某种特异细胞群的PBMC，用含10%FCS的培养基稀释至5×104～2×105个/孔如果条件可以达到更高的细胞数，建议可以尝试3×105～5×105个/孔，特别是在分泌细胞），分装于ELISPOT板孔中，再加入特异的刺激物，如多肽或基因表达产物，提取的抗原等，阴性对照孔中只加入培养基（实验中最好采用无血清的培养基，这样可以避免因为血清批次不同的差异所造成的误差，同时也避免血清的某些成份会引起非特异的反应），阳性对照孔加入植物血凝素(PHA，2μg/mL)或阳性多肽，37℃，体积比为5% CO2培养24～48h。要进行ELISPOT实验的细胞必需制备成为悬液的形式。利用ELISPOT的检测是十分灵敏的，频率低至10-12的分泌细胞都可以被检测出来。并且对于那些会贴壁的细胞也可以使用此种方法，虽然细胞生长贴壁后不易被洗去，但是不会妨碍最后斑点的显色。只要细胞可以正常分泌与抗体特异结合的产物，这些产物会逐步扩散到细胞四周，最后还是可以显示出斑点。
（3） 用含体积比0.01%Tween-20的PBS洗6次，以弃去细胞，加入生物素化抗细胞因子的检测抗体，孵育3h。再洗6次后，加入AP或HRP标记的链亲和素，室温孵育3h。
（4） 用PBS-Tween-20 再洗5次，加入底物 室温下显色，待出现紫色(AKP和底物的产物)或红色(HRP和底物的产物)斑点时，即可用立体解剖显微镜或计算机辅助成像分析系统计算斑点数，并用斑点形成单位(sfu/L百万加入细胞)记录结果。每一个斑点代表一个特异分泌CK的细胞。若预先包被抗原，则可用于ASC测定，这时，每一个斑点代表一个分泌特异抗体的细胞。
完成了以上步骤后其实只是完成了实验的一半。在你不断摸索反应的条件之后，得到了一块布满斑点的板，接下来要如何对这些斑点进行分析呢。如果利用显微镜人工技术无疑是太参有个人因素的实验了，实验结果肯定会被审稿人好好质疑一番。随后，有人使用数码相机拍摄下来后，使用photoshop进行处理、计数，这种方法也存在较多的个人因素。一项技术要普及，为广大研究人员所接受，就必需尽量减小人为的误差。所以，近年许多公司开始开发计算机辅助系统，使用系统设定的阈值对斑点进行人工智能计数。这样，由计算机将阴性对照中非特异反应斑点进行去除，同时由计算机进行统一计数，这样的实验结果置信度便大大提升了。目前判断的首要标准还是斑点的大小，但是做过电泳、同位素等的计算机成像的研究人员都遇到过一个问题：很多时候实验会产生一些较淡的斑点，用肉眼判断绝对是背景。所以在设计软件时也必需考虑到斑点深浅因素。计算机可以利用斑点的深浅、是否以中心为原点向四周减淡等特征对细胞分泌动力学特征进行分析，这项技术的成熟相信会使ELISPOT的应用范围更加扩宽。
（5） ELISPOT 斑点的判读像多数的Cell-based分析技术一样，ELISPOT Cytokine技术也是相当耗时、耗劳力的工作。事实上到目前为止，以目视法判读少量细胞族群的特性如激活T细胞之激素分泌，仍被视为是免疫学技术上的一大挑战。ELISPOT结果的判读常需要专聘、有经验的技术员才可以；有时就算有专职技师判读，使用传统的显微镜计算斑点数仍不免会偶有主观意见，而有所偏颇。
科学实证的本质，在于如何使实验结果能尽可能客观、精确、同时有高重现性，传统的人工计算法显然无法达到此一要求。故而有几个科研团队使自行开发Plate Scanner与自动分析软件，其中以Paul Lehmann教授研究开发之ImmunoSpot Analyzer自动分析仪最具代表性。分析ELISPOT实验数据的过程中，仪器先以高分辨率镜头捕捉微小孔中膜上呈色影像，而后储存成TIF檔；这些影像可以进一步使用手动、或是自动方式计算斑点数目，如果使用ImmuneSpot分析软件，可以先设定条件，然后同时分析斑点的大小，以推估激素分泌的多寡。预料像ImmunoSpot Analyzer这一类自动图像扫描分析仪器，将可克服传统显微镜判读方法耗费人力、及人为客观性等缺点，彻底解除ELISPOT分析技术的瓶颈问题，进一步推广该技术的新颖应用。
ImmunoSpot@影像扫描分析仪可以提供不同的数据格式，包括未处理与处理过的膜表面影像、每个小孔中的斑点数目、每个小孔中的平均斑点数目、每个小孔中斑点大小的直方统计图。
ELISPOT分析仪的出现解决了以下问题
哪些斑点是抗原特异性 T 细胞产生的（此斑点具有进一步分析价值），哪些是无关细胞产生的（此斑点没有 T 细胞研究价值）
斑点大小的意义 。
在对不同细胞因子计数和分析时，如何定义斑点最大和最小尺寸。
如何从单个细胞基础上分析 。
实验精确度有多高？如果一个细胞产生相似的细胞因子，在多大程度上会干扰分析结果。
几次重复实验才能使结果更有意义。
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ELISPOT技术优势及应用
ELISPOT的历史可以追溯到1963年Jerne等人创立的溶血空斑技术(hemo-lytic plaque forming cell assay，HPF)，这项技术可用于检测并计数单个抗体形成细胞。随着单克隆抗体技术的成熟，1983年，Czerkinsky等采用此法检测脾细胞中分泌特异性抗体的细胞数，发现该方法敏感性高简便易行。后来，他们又用这种方法定量分析受到有丝分裂原刺激的外周血中分泌IFN2γ的细胞数。随后，用ELISPOT法在单细胞水平检测分泌其他细胞因子(如IL-2，IL-4，IL-5，IL-10，TNFα和IL-6) 数量的手段也被建立起来。Nordstrom等用生物素-抗生物素蛋白生物放大法来提高这种方法的敏感性，Herr用计算机辅助图像分析系统(computer-assisted video image analysis，CVIA)自动分析TNF2α酶联免疫斑点的大小和数量，计算与负载抗原肽的靶细胞接触后外周血单核细胞(PBMC)中抗原特异性CD8+T细胞的数量，不但提高了对背景染色的分辨力也使大规模研究成为可能。Vaquerano等将数码相机和计算机结合起来，开发出类似的斑点计数系统，认为当每孔斑点数大于100时，这种方法更客观、可重复性高且节省时间。
随着ELISPOT技术的不断发展，它的优势也渐渐显示出来，下面将列举ELISPOT对比其它一些传统技术的优势所在。
ELISPOT 分析使单细胞分泌产物可视化。这些分析异常敏感，因为它是在直接在分泌细胞的周围进行捕捉，而且是在表面被冲淡，或者被临近的细胞上的受体捕获，或降解之前。最低至1：100万细胞精度的活体外频率测量。这种分辨率已经远远超过使用细胞内细胞因子的四聚物染色和ELISA法测量的精度。这种高敏感度是非常关键的，因为抗原特异性 T 细胞在体外都是典型性的低频率。高产量T细胞分析成为可行。一个经过训练的相关实验室小组可以测试成百的样本中几十种抗原的反应。只需要少量细胞，就可以用于通其他细胞学分析方法进行比较。例如，45毫升的血液就足以用于测试600种不同抗原/肽类物质的反应。可以定义CD4和CD8细胞的免疫因子指标。这是因为只需要少数细胞，分析就可以在高产量模式下进行。ELISPOT分析在筛选肽库，绘制免疫因子方面是一个理想的工具。 用于确定抗原特异性T细胞的功能性亲和力。这最大可能受到肽类药物刺激至50%的影响。可以用于研究未经药物处理过的细胞的分泌过程。如果观察到净产量减少，可以确定这种区别是来自分泌细胞的减少，还是每个细胞分泌产量的减少。淋巴细胞在ELISPOT分析后依然存活。这使得分析之后进行增值，用于更进一步的分析、克隆或者低温储藏成为可能低温储藏后的人类淋巴细胞可以用于检测，而不会丢失其功能。治疗前和治疗后的样本可以并排进行测试，结果可以重复。
（1） 与ELISA
ELISA 通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。ELISPOT 也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过计算机辅助的分析系统对斑点进行计数， 1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA更灵敏，能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。捕获抗体具有高亲和力、高特异性、低内毒素的单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。
与有限稀释法（limiting dilution analysis，LDA）
LDA能够对特异性CTL细胞进行定量，曾在很多年中被认为是CTL 检测的“金标准”，它使人们能够详细了解免疫反应动力学和记忆毒性T淋巴细胞(memorial CTL， mCTL) 亚群的细胞周期。但该方法需要高强度抗原刺激， 这会加快效应CTL(eCTL)凋亡，且不能定量测定eCTL细胞数量或测定值偏低。其次，该方法较繁琐，培养时间可长达2～3周，而且很容易造成T细胞数量损失。
（2） 与四聚体法（Tetramer）
最近几年出现了MHC2Ⅰ类分子抗原肽四聚体法。该法的优势在于迅速、直接、灵敏且特异性强，即使当体内mCTL水平低于1%，用MHC2Ⅰ抗原肽四聚体法仍可直接测到准确的值，比LDA 敏感度要高5～10倍。但该技术也存在较多应用上的困难：除了合成及稳定MHCⅠ类分子的技术困难外，最主要缺点是表位的选择。由于每次反应只能分析单一的抗原表位，而MHCⅠ类分子结合的各种表位，能否形成CTL反应，却随着基因背景及时间的变化而变化，因此选择正确的表位就显得尤为重要。优势表位的筛选可以通过Elispot 来进行，但对整个肽库进行扫描，并不是一件很容易的事。当然，生物信息学的运用对表位的筛选有很大的帮助。同时，有研究结果表明，并非所有经过Tetramer 鉴定的阳性细胞都有确切的功能， Tetramer阳性的细胞数是用ELISPOT分析能分泌INF2γ细胞数的10倍，其中很多是不表现功能的惰性细胞，可能代表了记忆型CTL前体细胞。Tetramer分析只增加了分析的灵敏度，同时测定其功能很重要。
（3） 与Cr51释放法
此法是一种比较经典的方法，虽然在检测CTL识别的抗原多样性方面非常有效，且能精确阐明被CTL识别的最佳表位，但至多为半定量的层面，而且Cr51标记细胞的自发释放率较高，不适于较长时间培养；标记时所需的细胞浓度较高，因而给试验带来诸多不便；此外，Cr51释放法所测定的是一个细胞群体的特性，而不是单个细胞。
（4） 与胞内CK染色法
与ELISPOT法相比较，胞内CK染色法(intra-cellular CK staining，ICS) 主要应用细胞内累积细胞因子的染色和多色参数的FACS法，是检测循环淋巴细胞中抗原特异性T 淋巴细胞的可行方法，而ELISPOT法却可以检测所有分泌CK的eCTL 。
应用
目前，ELISPOT已被用于检测药物、化学制剂及其它CK复合物的特性及功能等方面，因此为体内免疫功能的调节效应提供了检测依据。近几年来， ELISPOT技术在肿瘤疫苗评价试验、免疫监测及免疫学研究中越来越被广泛地使用。
（1） 在抗肿瘤免疫及相关领域中的应用
在许多研究中，该技术已被用于免疫动物外周血淋巴细胞中抗原特异的细胞毒性T细胞(CTL)的数量检测。近期，ELISPOT技术已用于分析和评价从传染病病人的PBMC中检测肽特异的T淋巴细胞以及在癌症病人中诱导肿瘤特异的T细胞的疫苗试验。
ELISPOT检测T细胞反应时敏感性、特异性和可重复性都很高，操作简单迅速，需要少量标本，在检测抗原特异性细胞数量的同时也反应其功能，并与临床结果相关。ELISPOT平板可以提前大量准备，移液、洗板和读板都可自动化，因而大批量检查也可做到快速高效。在与与其他方法的比较后，ELISPOT很可能成为定量分析肿瘤或病毒特异性的T细胞反应的首选。
（2） 在抗感染免疫中的应用
CTL在抗病毒感染的免疫应答中占有主要地位，而CD4+辅助性T细胞亚群Th1/Th2的平衡在抵御病毒感染中起着同样重要的作用。在HIV研究方面，由MHC-1类分子加工的不同抗原经CTL识别并产生免疫应答在控制HIV-1感染中同样起重要作用。利用ELISPOT方法检测CK如IFN2γ就可以进一步了解到针对HIV特异的CTL应答及相关免疫信息。
此外，ELISPOT法还用于评价由HIV-1感染引起粘膜的CD4+T细胞免疫应答以及HIVgp 120g与霍乱毒素共表达的DNA疫苗的免疫源性。在其他研究中，ELISPOT还用来检测通过直肠免疫低剂量甲肝疫苗而产生的细胞免疫应答。在急性的自限性肝炎中，以Th1为主的应答促进细胞介导的免疫，且在控制病毒感染及延缓慢性疾病的发展方面有重要作用。
在许多抗细菌免疫研究中，该方法也发挥了重要作用。例如：应用ELISPOT试验证实表达大肠杆菌MalE蛋白的重组卡介苗(rBCG.MalE)诱导的T细胞应答是CD4+T细胞依赖的，rBCG.MalE 诱导的特异CD4+T细胞应答存在Th1/Th2平衡转换现象，并逐步形成Th1/ Th2 混合应答。
（3） 临床方面
目前，已经实现临床检验的领域是对肺结核（TB）的检测。而最近的研究热点就是对于移植的预测。受体对供体特异性HLA抗体一直以来都是器官移植的一大障碍，因为它们的存在不仅介导超急性排斥反应而且还可导致急性排斥反应。因此，HLA抗体的存在限制了异体抗原敏感患者对供体器官的需要，因而增加了等待移植的时间。在心脏，肝脏和肾脏异体移植后早期出现的并发症如急性排斥反应与移植前存在的异体免疫临床相关性迫切需要一种恰当的检测方法在器官移植前能了解受体对供体特异性体液免疫的功能状态。
在接受移植的人群中，部分因有多次输血、或既往有异体移植失败或多次妊娠史体内曾经存在阳性异体抗体，在他们接受异体移植时，现有的检测方法只能显示他们对异体的免疫功能正常。但他们体内存在记忆B淋巴细胞，一旦受到相应HLA 抗原的刺激则会唤起免疫反应，这不仅影响着移植的结果，甚至会出现危及患者生命的、与移植相关的并发症。
ELISPOT是一种强有效的检测单个抗体分泌细胞的方法，具有很高的敏感性。因此，刺激记忆B淋巴细胞增殖、分化成浆细胞，并建立一种特异性ELISPOT方法检测HLA抗体产生细胞是最佳手段。 如果ELISPOT要进一步推广应用，特别是临床应用，其标准化将是一个十分重要的问题。美国FDA和NIH等已经开始建立ELISPOT的标准化流程，相信随着ELISPOT技术的成熟、标准化程序的建立，它的应用将更加广泛。
ELISPOT 实验方案
对应BD的试剂盒
实验材料的准备
试剂盒中没有但是必须的
材料:
• 已消毒的移液器 (Gilson)。单道20ul,100ul,200ul,1ml, 8/12道200ul
• 无菌一次性聚苯乙烯吸量管 (1ml, 5ml, 10ml）(Axygen)。
• 一次性乳胶手套 。
• 无菌一次性离心管（15ml、50ml）(Corning cat#430052 and 430290)。
• 吸水纸(卫生纸)
• 无菌tip头, 200ul,1ml,
试剂:
1. PBS 无菌 300ml/10板，有菌4000ml/10板 在准备包被抗体时不要使用商业化的PBS
2. ddH2O(无菌) 对于10块ELISPOT板，200 ml
3. 有菌洗涤缓冲液(PBST)：有菌3000ml/10板
Tween-20 进口
4. 有菌洗涤缓冲液(PBS)：有菌1000ml/10板
5. 培养液：无血清培养基 （P/S, 2 mM 的谷氨酰胺，以及 Hepes buffer）。
6. PMA ＋ionomycin.
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA; Sigma Chemical Co., product nr. P8139 is recommended).
PMA
贮 存 液：PMA溶于DMSO，浓度为1mg/ml，-20℃保存
工 作 液：贮存液 1:4000稀释于无血清培养基中
此时为 250ng/ml
Calcium ionophore (ionomycin; Sigma Chemical Co, product nr. I0634 is recommended).
Ionomycin
贮 存 液：Ionomycin溶于DMSO，浓度为1mg/ml，-20℃保存
工 作 液：贮存液 1:200稀释于无血清培养基中
此时为 5μg/ml
50ml混合刺激剂＝PMA工作液12.5ul，Ionomycin工作液250ul，无血清培养基补齐
7. 10% 热灭活胎牛血清 (Hyclone cat# ALH14384 )
8. 抗原
设备:
• 洗板器: 自动或手动 (洗瓶, 手动分液器等)。
•专用CO2-细胞培养箱 (37°C)。
4°C冰箱
无菌间无菌操作台
Preparation kit reagents
1．包被用抗体
取50 μl加到10ml PBS中。（足够包被1块96孔板，100 μl/well）。
对10块板子， 500ul加到100ml PBS中
2．生物素标记的检测抗体（detector antibody）
取50μl加到10 ml Dilution buffer中。（混匀后加入ELISPOT板，100 μl/well）。
对10块板子， 500ul 加到100ml Dilution buffer(PBS+10%FBS)
3．STREP-HRP
取100μl加到10 ml Dilution buffer中。（混匀后加入ELISPOT板，100 μl/孔）。
对10块板子， 1ml 加到100ml Dilution buffer
4 显色激活系统（Activation system）
对于1块ELISPOT板，200ul AEC Chromogen + 10 ml AEC Substrate，混匀，10分钟内用完。（100 μl/孔）。
ELSPOT实验步骤
Day 1
包被ELISPOT板 16：30
1. 在ELISPOT板中每孔加入包被抗体100μl，4℃ 过夜。
Day 2
ELISPOT板的封闭 17：00
2. 取出已包被的ELISPOT板，吸弃每孔中的包被抗体溶液。
3. 用完全无血清培养基洗1次。
4. 在ELISPOT板中，每孔加入200μl完全无血清培养基。室温2h。(8道排枪)
5.
PBMC加入ELISPOT培养板 20：00
6. 取出封闭2h的ELISPOT板，吸弃每孔中的封闭液。(不要洗板！)
7. 在ELISPOT板中，先加30μl 无血清培养基(12道排枪)和20μl肽库(8道排枪)，后加50μl细胞(8道排枪) (每孔活细胞总数为2×105，每个病人需活细胞总数为10×106，体积为2.5 ml。每条多肽的终浓度为5μg/ml，活细胞的工作浓度为4×106/ml，活细胞的终浓度为2×106/ml）。
阳性孔中每孔加入50μl 细胞和30μl无血清培养基和20μl PMA+Inomysin（工作液浓度分别为250ng/ml和5ug/ml，终浓度分别为50ng/ml和1ug/ml）。
8. 用low evaporation lid 盖好ELISPOT板，放入37℃ CO2孵箱培养30 h。
注意：不要晃动ELISPOT板。
Day 4
二抗和GABA标记，显色反应 8：30
9. 培养30h后，取出ELISPOT板，甩去细胞后。
10. 用去离子水洗涤2次。每次浸泡5分钟。
11. 用0.05％PBST洗涤3次。每次浸泡2分钟。
12. 每孔加入100μl 生物素化的detector Ab(8道排枪)。室温2小时。
13. 取出ELISPOT板，倒去detector Ab溶液，用PBST洗涤3次。每次浸泡2分钟
每孔加入100μl Strep-HRP溶液(8道排枪)。室温1小时
14. 取出ELISPOT板，倒去Strep-HRP溶液。
15. PBST洗涤4次。每次浸泡2分钟。
16. 用PBS洗涤2次。每次浸泡2分钟。
17. 洗涤完毕后，在吸水纸上轻轻拍干ELISPOT板。
每块板子200ul AEC Chromogen + 10 ml AEC Substrate，混匀，15分钟内用完。
18. 每孔加入100 µl 配好的substrate(8道排枪)。在暗处、室温下孵育（5～60分钟）。
出现斑点后，用自来水冲洗，中止反应。室温下干燥，检测。
在免疫学领域中，对于疾病以及疫苗研究不仅仅局限于体液免疫应答（B细胞免疫），细胞介导的免疫应答(cell mediated immune response，CMI)也是人们所关注的，而T细胞在CMI中起关键作用。在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法（ELISA）检测体液中游离的细胞因子（CK）或抗体，但由于游离的循环抗体或CK的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK的水平。 80 年代，国外的科研工作者根据 ELISA 技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和 CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ ELISPOT ）。作为一项新型的免疫酶技术——酶联免疫斑点法(enzyme linked immunospot assay，ELISPOT)，是从单细胞水平检测分泌抗体细胞(ASC) 或分泌细胞因子(CK) 细胞的一项细胞免疫学检测技术。由于该方法具有较高的特异性和敏感性，易操作，成本相对流式细胞分析术也较低，已被广泛用于分泌CK细胞检测或ASC测定中，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。
ELISPOT 法源自 ELISA，又突破传统 ELISA 法，是定量 ELISA 技术的延伸和新的发展。两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同在于：
（1） ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。
（2） ELISPOT也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT 分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）
由于是单细胞水平检测， ELISPOT 比 ELISA 和有限稀释法等更灵敏，能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。捕获抗体为高亲和力、高特异性、低内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。
下面将从发展、原理、具体实验操作、技术优势和应用几方面进行介绍。
ELISPOT技术的发展
（1） ELISPOT技术的过去
ELISPOT是20多年前便己研发成功的老技术。Czerkinsky 等人率先在1983年，运用该技术成功地检测出因受激而分泌抗体的B细胞频率。从那时起世界各国免疫学者便开始一长期的ELISPOT Cytokine技术竞赛，每个团队都希望能率先将此一技术推广来研究T细胞免疫，其绝妙之处在提供一接近体内实验的环境，藉由侦测T细胞分泌的各类细胞因子，来定量机体内免疫反应启始者Precursor T的clonal size族群大小，同时预测体内免疫系统即将进行的下游免疫反应。
ELISPOT Cytokine技术虽说操作简单，但该技术并没能如预期地很快地被成功应用在ex vivo T细胞功能研究。要让ELISPOT技术从B细胞免疫走向T细胞免疫的产生的第一个主要问题，便是灵敏度的提升，因为T细胞因子较之B细胞免疫球蛋白产量极少。早期ELISPOT的分析条件不是非常理想，成对抗体的品质、呈色底膜的材质等几个技术性的问题，使当时多数研究团队很难获得清晰的斑点，结果是敏感度不够、数据分析重现性低。这问题直到1996美国俄亥俄卅Case Western Reserve大学Paul Lehmann团队引进PVDF薄膜的应用（Forsthuber et al., Science, 1996），才釜底抽薪地解决了该技术因斑点呈色问题造成低敏感度的缺失。与原来的标准膜面相比，PVDF薄膜提供1,000倍的较大面积来吸附单株抗体，使T细胞分泌的各类细胞因子能在细胞周围就近被俘虏，让呈色斑点集中、清晰、对比色高，大大的提高ELISPOT Cytokine分析的敏感度。图一是使用PVDF-BASED改良薄膜（Panel A）与传统标准薄膜（Panel B）并行实验的比较结果。同样的人体 PBMC样品，在通过完全相同的实验，Panel A呈现较清晰的小色点。
第二个技术性问题是ELISPOT Cytokine实验分析的几个基本假设缺乏科学实证，也使得该技术在当时并没受到该有的广泛重视。没有科研人员尝试去厘清一些基础但很重要的问题，诸如：
实验所得的斑点是抗原特定T细胞所生产，还是旁观细胞受Cytokine刺激的次级效应？
斑点的小或大有何生理意义；如何决定cutoff值？
能否相信斑点是由单一的细胞造成？
ELISPOT Cytokine分析技术能准确测量的频率范围？
如果效应相互拮抗的cytokine同时产生，它们是否会互相妨碍？及到什么程度？
（2） ELISPOT 技术的现在
1996年以来随着抗体制备、PVDF膜材篁等技术改良，ELISPOT 分析技术已经逐渐达到科研人员的期待，它已是当世公认最灵敏抗原特定T细胞的体外检测技术。藉由检验新鲜分离PBMC细胞所分泌cytokine的指纹，ELISPOT 分析技术可提示T细胞免疫系统的两个重要参数：抗原特定T细胞的clone族群大小；和免疫效应细胞的信号传导路径Th1/Th2。
多年来经过数十个研究团队的致力研究，对于ELISPOT分析技术本身的几个问题，也有了科学上的验证。目前一般公认，ELISPOT技术允许科研人员在单细胞水平上识别抗原特定T细胞，主要针对经由CD4或者CD8细胞的免疫反应。在适当的实验设计下，ELISPOT Cytokine 斑点的数量分析显示斑点是由一个单细胞所生成，同时斑点形态学与Time Response分析则显示斑点直径大小直接反映该细胞族群的产能。也因为如此，ELISPOT是个免疫学上的标竿技术，它可以允许科研人员在几乎自然生理条件下，观察细胞实际分泌Cytokine的进程，进而可以得到药理学信息，阐明免疫调节药物如何影响T细胞分泌各类cytokine的速率。药物抑制T细胞免疫一般可通过两程截然不同的机转；使能分泌Cytokine的Precursor T细胞族群变小，或减少每Precursor T细胞的cytokine产能，而ELISPOT技术能提供双份信息。
ELISPOT分析技术的几个特点已经让它在抗原特定T细胞免疫学上独占鳌头。此技术是当世唯一准许百万分之一1:1000,000的准确分析，如此强效的解析力使流式细胞技术也望其项背，以目前国内外常规的intracellular cytokine或者Dimer/ tetramer染色，流式技术的灵敏度一般限制在1:10,000。这样的高灵敏度对T细胞免疫学研究是必须的，因为抗原特定T细胞一般在机体周边循环系统发生的频率通常低于万中取一。此外由于ELISPOT Cytokine技术被证实适用于冰冻后复苏的人类淋巴球，解冻后PMBC与新鲜分离样品有相当的效价，没有丧失功能。这一点对临床试验非常重要，它使科研人员得以并行分析免疫治疗前、后的病人血样，如果试验牵涉全国多个临床试验机构，病人血样可冰存并同时集中在「中央实验室」一齐被测试。同理，一个血样或标准对照品可被分装小份，被送到不同检验中心进行测试，以交互比对，同时有利ELISPOT Cytokine技术流程的规范化、标准化。
（3） ELISPOT 未来展望
ELISPOT 分析技术正在欧美各国发挥它的完整潜能，它让免疫学家可以直接洞察活体内T细胞相关生理学或病理学，就像是心脏外科医师手上的那张心电图，经由这个技术科研人员可以在活体内直接进入一个器官系统，在那里视察、发掘，得到全新的智识。
从各国文献可见ELISPOT技术已经达到标准化、规范化的要求，并被广泛地应用在多项领域，包括监视癌症病人接受免疫疗程时的反应(Lewis, 2000 and Janetzki, 2000)，以及感染性疾病(Moss, 2000, Rahman, 2000, Rowland-Jones, 1998, Herr, 1997 and Lechner, 2000)、肿瘤(Nagorsen, 2000)、或自体免疫病人体内的一个特定的免疫反应型式(Pelfrey, 2000)。ELISPOT技术同时也在数个疫苗效价评估人体试验中，被当成重要的终结指针。2003年1月，世界卫生组织通过与大陆北京性艾中心合作，将应用ELISPOT技术来监测HIV疫苗研究免疫应答反应技术，该计划将是首次利用ELISPOT技术对亚洲国家从事HIV疫苗研究和临床试验的有关研究。我们期待未来此技术能在我国免疫学界得到广泛地应用。
原理
ELISPOT就其原理来说实在是很简单的，从本质上说和ELISA的原理是一样的，理解起来并不难。细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT 底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。传统的ELISA与ELISPOT都是根据酶免疫学检测原理，通过酶的高催化频率，放大反应效果，从而达到很高敏感度的检测效果。
ELISPOT全名为Enzyme-linked Immunospot Assay，其技术原理与ELISA相似。其实验设计是在96微孔培养盘底部披覆PVDF薄膜，用来吸附特殊挑选、且无毒性（不含sodium azide、内毒素endotoxin）的单株抗体。静脉血PBMC细胞经适当分离处理后，会被分配到微孔盘上，再接受适当的抗原刺激，并将微孔盘放置于温箱中过夜培养一段时间。一般而言，记忆型T细胞在受抗原刺激数小时后会开始分泌细胞激素，此时局部(在紧靠分泌细胞的周围)分泌出的细胞激素会被PVDF薄膜上特异抗体捕获。微孔盘中的细胞被移除并清洗后，被捕获的细胞激素可进一步使用生物素（Biotin）标记的二次抗体来标志，其后再以结合酵素的StreptAvidin与之作用，并加入酵素受质使其呈色，有反应作用的细胞会留下染色斑点。
反应步骤可大致分为：
（1） 利用特定细胞因子的单克隆抗体包被96孔板，封闭剩余的空白位点；
（2） 加入细胞悬液，用特异性抗原刺激、活化细胞，产生细胞因子，细胞因子会往附近扩散与之前包被的抗体进行特异结合；
（3） 洗掉细胞；
（4） 加入酶标二抗特异与细胞因子进行结合，通过底物的显色反应，一个细胞所在位置就会显出斑点，最后利用显微镜或者特定的读板机（reader）就可以计算出样品中被激活细胞的数目。
以上是检测分泌细胞因子细胞的流程，如果是检测分泌特异抗体的细胞只需把包被特异抗体变为包被特异抗原即可。
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ELISPOT技术实验步骤
从原理上看ELISPOT的确很简单，但是在操作过程中有许多条件需要摸索，所以这里进一步介绍一下ELISPOT的操作步骤。
（1） 将适量捕获性抗体预先包被于96孔ELISPOT板上，用胶带封板并在4℃孵育过夜。将板用PBS洗6遍，再用含体积比10%胎牛血清(FCS)的培养基封闭，室温下孵育至少1h。FCS可以封闭所包被抗体的FCS受体以降低非特异性反应。有一种特殊的96孔板底面介质是PVDF膜，利用膜的多孔结构可以让单个细胞坐到其中，然后分泌细胞因子或特定抗体，这样使最后的检测单个细胞灵敏度成为可能。同时，PVDF膜的不透光性也是ELISPOT与ELISA的不同之处。理论上是可以同时包被两个不同的抗体的，两种不同的抗体可以利用不同的显色系统显出不同颜色，但是这样就要考虑到不同抗体间的不亲和性，必需保证每种抗体包被的数量要足够。如果是使用试剂盒的预包被板，这一步就可以省略啦。
（2） 将阴性对照和细胞样品，如外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，经纯化的CD8+T细胞或去除某种特异细胞群的PBMC，用含10%FCS的培养基稀释至5×104～2×105个/孔如果条件可以达到更高的细胞数，建议可以尝试3×105～5×105个/孔，特别是在分泌细胞），分装于ELISPOT板孔中，再加入特异的刺激物，如多肽或基因表达产物，提取的抗原等，阴性对照孔中只加入培养基（实验中最好采用无血清的培养基，这样可以避免因为血清批次不同的差异所造成的误差，同时也避免血清的某些成份会引起非特异的反应），阳性对照孔加入植物血凝素(PHA，2μg/mL)或阳性多肽，37℃，体积比为5% CO2培养24～48h。要进行ELISPOT实验的细胞必需制备成为悬液的形式。利用ELISPOT的检测是十分灵敏的，频率低至10-12的分泌细胞都可以被检测出来。并且对于那些会贴壁的细胞也可以使用此种方法，虽然细胞生长贴壁后不易被洗去，但是不会妨碍最后斑点的显色。只要细胞可以正常分泌与抗体特异结合的产物，这些产物会逐步扩散到细胞四周，最后还是可以显示出斑点。
（3） 用含体积比0.01%Tween-20的PBS洗6次，以弃去细胞，加入生物素化抗细胞因子的检测抗体，孵育3h。再洗6次后，加入AP或HRP标记的链亲和素，室温孵育3h。
（4） 用PBS-Tween-20 再洗5次，加入底物 室温下显色，待出现紫色(AKP和底物的产物)或红色(HRP和底物的产物)斑点时，即可用立体解剖显微镜或计算机辅助成像分析系统计算斑点数，并用斑点形成单位(sfu/L百万加入细胞)记录结果。每一个斑点代表一个特异分泌CK的细胞。若预先包被抗原，则可用于ASC测定，这时，每一个斑点代表一个分泌特异抗体的细胞。
完成了以上步骤后其实只是完成了实验的一半。在你不断摸索反应的条件之后，得到了一块布满斑点的板，接下来要如何对这些斑点进行分析呢。如果利用显微镜人工技术无疑是太参有个人因素的实验了，实验结果肯定会被审稿人好好质疑一番。随后，有人使用数码相机拍摄下来后，使用photoshop进行处理、计数，这种方法也存在较多的个人因素。一项技术要普及，为广大研究人员所接受，就必需尽量减小人为的误差。所以，近年许多公司开始开发计算机辅助系统，使用系统设定的阈值对斑点进行人工智能计数。这样，由计算机将阴性对照中非特异反应斑点进行去除，同时由计算机进行统一计数，这样的实验结果置信度便大大提升了。目前判断的首要标准还是斑点的大小，但是做过电泳、同位素等的计算机成像的研究人员都遇到过一个问题：很多时候实验会产生一些较淡的斑点，用肉眼判断绝对是背景。所以在设计软件时也必需考虑到斑点深浅因素。计算机可以利用斑点的深浅、是否以中心为原点向四周减淡等特征对细胞分泌动力学特征进行分析，这项技术的成熟相信会使ELISPOT的应用范围更加扩宽。
（5） ELISPOT 斑点的判读像多数的Cell-based分析技术一样，ELISPOT Cytokine技术也是相当耗时、耗劳力的工作。事实上到目前为止，以目视法判读少量细胞族群的特性如激活T细胞之激素分泌，仍被视为是免疫学技术上的一大挑战。ELISPOT结果的判读常需要专聘、有经验的技术员才可以；有时就算有专职技师判读，使用传统的显微镜计算斑点数仍不免会偶有主观意见，而有所偏颇。
科学实证的本质，在于如何使实验结果能尽可能客观、精确、同时有高重现性，传统的人工计算法显然无法达到此一要求。故而有几个科研团队使自行开发Plate Scanner与自动分析软件，其中以Paul Lehmann教授研究开发之ImmunoSpot Analyzer自动分析仪最具代表性。分析ELISPOT实验数据的过程中，仪器先以高分辨率镜头捕捉微小孔中膜上呈色影像，而后储存成TIF檔；这些影像可以进一步使用手动、或是自动方式计算斑点数目，如果使用ImmuneSpot分析软件，可以先设定条件，然后同时分析斑点的大小，以推估激素分泌的多寡。预料像ImmunoSpot Analyzer这一类自动图像扫描分析仪器，将可克服传统显微镜判读方法耗费人力、及人为客观性等缺点，彻底解除ELISPOT分析技术的瓶颈问题，进一步推广该技术的新颖应用。
ImmunoSpot@影像扫描分析仪可以提供不同的数据格式，包括未处理与处理过的膜表面影像、每个小孔中的斑点数目、每个小孔中的平均斑点数目、每个小孔中斑点大小的直方统计图。
ELISPOT分析仪的出现解决了以下问题
哪些斑点是抗原特异性 T 细胞产生的（此斑点具有进一步分析价值），哪些是无关细胞产生的（此斑点没有 T 细胞研究价值）
斑点大小的意义 。
在对不同细胞因子计数和分析时，如何定义斑点最大和最小尺寸。
如何从单个细胞基础上分析 。
实验精确度有多高？如果一个细胞产生相似的细胞因子，在多大程度上会干扰分析结果。
几次重复实验才能使结果更有意义。
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ELISPOT技术优势及应用
ELISPOT的历史可以追溯到1963年Jerne等人创立的溶血空斑技术(hemo-lytic plaque forming cell assay，HPF)，这项技术可用于检测并计数单个抗体形成细胞。随着单克隆抗体技术的成熟，1983年，Czerkinsky等采用此法检测脾细胞中分泌特异性抗体的细胞数，发现该方法敏感性高简便易行。后来，他们又用这种方法定量分析受到有丝分裂原刺激的外周血中分泌IFN2γ的细胞数。随后，用ELISPOT法在单细胞水平检测分泌其他细胞因子(如IL-2，IL-4，IL-5，IL-10，TNFα和IL-6) 数量的手段也被建立起来。Nordstrom等用生物素-抗生物素蛋白生物放大法来提高这种方法的敏感性，Herr用计算机辅助图像分析系统(computer-assisted video image analysis，CVIA)自动分析TNF2α酶联免疫斑点的大小和数量，计算与负载抗原肽的靶细胞接触后外周血单核细胞(PBMC)中抗原特异性CD8+T细胞的数量，不但提高了对背景染色的分辨力也使大规模研究成为可能。Vaquerano等将数码相机和计算机结合起来，开发出类似的斑点计数系统，认为当每孔斑点数大于100时，这种方法更客观、可重复性高且节省时间。
随着ELISPOT技术的不断发展，它的优势也渐渐显示出来，下面将列举ELISPOT对比其它一些传统技术的优势所在。
ELISPOT 分析使单细胞分泌产物可视化。这些分析异常敏感，因为它是在直接在分泌细胞的周围进行捕捉，而且是在表面被冲淡，或者被临近的细胞上的受体捕获，或降解之前。最低至1：100万细胞精度的活体外频率测量。这种分辨率已经远远超过使用细胞内细胞因子的四聚物染色和ELISA法测量的精度。这种高敏感度是非常关键的，因为抗原特异性 T 细胞在体外都是典型性的低频率。高产量T细胞分析成为可行。一个经过训练的相关实验室小组可以测试成百的样本中几十种抗原的反应。只需要少量细胞，就可以用于通其他细胞学分析方法进行比较。例如，45毫升的血液就足以用于测试600种不同抗原/肽类物质的反应。可以定义CD4和CD8细胞的免疫因子指标。这是因为只需要少数细胞，分析就可以在高产量模式下进行。ELISPOT分析在筛选肽库，绘制免疫因子方面是一个理想的工具。 用于确定抗原特异性T细胞的功能性亲和力。这最大可能受到肽类药物刺激至50%的影响。可以用于研究未经药物处理过的细胞的分泌过程。如果观察到净产量减少，可以确定这种区别是来自分泌细胞的减少，还是每个细胞分泌产量的减少。淋巴细胞在ELISPOT分析后依然存活。这使得分析之后进行增值，用于更进一步的分析、克隆或者低温储藏成为可能低温储藏后的人类淋巴细胞可以用于检测，而不会丢失其功能。治疗前和治疗后的样本可以并排进行测试，结果可以重复。
（1） 与ELISA
ELISA 通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。ELISPOT 也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过计算机辅助的分析系统对斑点进行计数， 1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA更灵敏，能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。捕获抗体具有高亲和力、高特异性、低内毒素的单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。
与有限稀释法（limiting dilution analysis，LDA）
LDA能够对特异性CTL细胞进行定量，曾在很多年中被认为是CTL 检测的“金标准”，它使人们能够详细了解免疫反应动力学和记忆毒性T淋巴细胞(memorial CTL， mCTL) 亚群的细胞周期。但该方法需要高强度抗原刺激， 这会加快效应CTL(eCTL)凋亡，且不能定量测定eCTL细胞数量或测定值偏低。其次，该方法较繁琐，培养时间可长达2～3周，而且很容易造成T细胞数量损失。
（2） 与四聚体法（Tetramer）
最近几年出现了MHC2Ⅰ类分子抗原肽四聚体法。该法的优势在于迅速、直接、灵敏且特异性强，即使当体内mCTL水平低于1%，用MHC2Ⅰ抗原肽四聚体法仍可直接测到准确的值，比LDA 敏感度要高5～10倍。但该技术也存在较多应用上的困难：除了合成及稳定MHCⅠ类分子的技术困难外，最主要缺点是表位的选择。由于每次反应只能分析单一的抗原表位，而MHCⅠ类分子结合的各种表位，能否形成CTL反应，却随着基因背景及时间的变化而变化，因此选择正确的表位就显得尤为重要。优势表位的筛选可以通过Elispot 来进行，但对整个肽库进行扫描，并不是一件很容易的事。当然，生物信息学的运用对表位的筛选有很大的帮助。同时，有研究结果表明，并非所有经过Tetramer 鉴定的阳性细胞都有确切的功能， Tetramer阳性的细胞数是用ELISPOT分析能分泌INF2γ细胞数的10倍，其中很多是不表现功能的惰性细胞，可能代表了记忆型CTL前体细胞。Tetramer分析只增加了分析的灵敏度，同时测定其功能很重要。
（3） 与Cr51释放法
此法是一种比较经典的方法，虽然在检测CTL识别的抗原多样性方面非常有效，且能精确阐明被CTL识别的最佳表位，但至多为半定量的层面，而且Cr51标记细胞的自发释放率较高，不适于较长时间培养；标记时所需的细胞浓度较高，因而给试验带来诸多不便；此外，Cr51释放法所测定的是一个细胞群体的特性，而不是单个细胞。
（4） 与胞内CK染色法
与ELISPOT法相比较，胞内CK染色法(intra-cellular CK staining，ICS) 主要应用细胞内累积细胞因子的染色和多色参数的FACS法，是检测循环淋巴细胞中抗原特异性T 淋巴细胞的可行方法，而ELISPOT法却可以检测所有分泌CK的eCTL 。
应用
目前，ELISPOT已被用于检测药物、化学制剂及其它CK复合物的特性及功能等方面，因此为体内免疫功能的调节效应提供了检测依据。近几年来， ELISPOT技术在肿瘤疫苗评价试验、免疫监测及免疫学研究中越来越被广泛地使用。
（1） 在抗肿瘤免疫及相关领域中的应用
在许多研究中，该技术已被用于免疫动物外周血淋巴细胞中抗原特异的细胞毒性T细胞(CTL)的数量检测。近期，ELISPOT技术已用于分析和评价从传染病病人的PBMC中检测肽特异的T淋巴细胞以及在癌症病人中诱导肿瘤特异的T细胞的疫苗试验。
ELISPOT检测T细胞反应时敏感性、特异性和可重复性都很高，操作简单迅速，需要少量标本，在检测抗原特异性细胞数量的同时也反应其功能，并与临床结果相关。ELISPOT平板可以提前大量准备，移液、洗板和读板都可自动化，因而大批量检查也可做到快速高效。在与与其他方法的比较后，ELISPOT很可能成为定量分析肿瘤或病毒特异性的T细胞反应的首选。
（2） 在抗感染免疫中的应用
CTL在抗病毒感染的免疫应答中占有主要地位，而CD4+辅助性T细胞亚群Th1/Th2的平衡在抵御病毒感染中起着同样重要的作用。在HIV研究方面，由MHC-1类分子加工的不同抗原经CTL识别并产生免疫应答在控制HIV-1感染中同样起重要作用。利用ELISPOT方法检测CK如IFN2γ就可以进一步了解到针对HIV特异的CTL应答及相关免疫信息。
此外，ELISPOT法还用于评价由HIV-1感染引起粘膜的CD4+T细胞免疫应答以及HIVgp 120g与霍乱毒素共表达的DNA疫苗的免疫源性。在其他研究中，ELISPOT还用来检测通过直肠免疫低剂量甲肝疫苗而产生的细胞免疫应答。在急性的自限性肝炎中，以Th1为主的应答促进细胞介导的免疫，且在控制病毒感染及延缓慢性疾病的发展方面有重要作用。
在许多抗细菌免疫研究中，该方法也发挥了重要作用。例如：应用ELISPOT试验证实表达大肠杆菌MalE蛋白的重组卡介苗(rBCG.MalE)诱导的T细胞应答是CD4+T细胞依赖的，rBCG.MalE 诱导的特异CD4+T细胞应答存在Th1/Th2平衡转换现象，并逐步形成Th1/ Th2 混合应答。
（3） 临床方面
目前，已经实现临床检验的领域是对肺结核（TB）的检测。而最近的研究热点就是对于移植的预测。受体对供体特异性HLA抗体一直以来都是器官移植的一大障碍，因为它们的存在不仅介导超急性排斥反应而且还可导致急性排斥反应。因此，HLA抗体的存在限制了异体抗原敏感患者对供体器官的需要，因而增加了等待移植的时间。在心脏，肝脏和肾脏异体移植后早期出现的并发症如急性排斥反应与移植前存在的异体免疫临床相关性迫切需要一种恰当的检测方法在器官移植前能了解受体对供体特异性体液免疫的功能状态。
在接受移植的人群中，部分因有多次输血、或既往有异体移植失败或多次妊娠史体内曾经存在阳性异体抗体，在他们接受异体移植时，现有的检测方法只能显示他们对异体的免疫功能正常。但他们体内存在记忆B淋巴细胞，一旦受到相应HLA 抗原的刺激则会唤起免疫反应，这不仅影响着移植的结果，甚至会出现危及患者生命的、与移植相关的并发症。
ELISPOT是一种强有效的检测单个抗体分泌细胞的方法，具有很高的敏感性。因此，刺激记忆B淋巴细胞增殖、分化成浆细胞，并建立一种特异性ELISPOT方法检测HLA抗体产生细胞是最佳手段。 如果ELISPOT要进一步推广应用，特别是临床应用，其标准化将是一个十分重要的问题。美国FDA和NIH等已经开始建立ELISPOT的标准化流程，相信随着ELISPOT技术的成熟、标准化程序的建立，它的应用将更加广泛。
ELISPOT 实验方案
对应BD的试剂盒
实验材料的准备
试剂盒中没有但是必须的
材料:
• 已消毒的移液器 (Gilson)。单道20ul,100ul,200ul,1ml, 8/12道200ul
• 无菌一次性聚苯乙烯吸量管 (1ml, 5ml, 10ml）(Axygen)。
• 一次性乳胶手套 。
• 无菌一次性离心管（15ml、50ml）(Corning cat#430052 and 430290)。
• 吸水纸(卫生纸)
• 无菌tip头, 200ul,1ml,
试剂:
1. PBS 无菌 300ml/10板，有菌4000ml/10板 在准备包被抗体时不要使用商业化的PBS
2. ddH2O(无菌) 对于10块ELISPOT板，200 ml
3. 有菌洗涤缓冲液(PBST)：有菌3000ml/10板
Tween-20 进口
4. 有菌洗涤缓冲液(PBS)：有菌1000ml/10板
5. 培养液：无血清培养基 （P/S, 2 mM 的谷氨酰胺，以及 Hepes buffer）。
6. PMA ＋ionomycin.
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA; Sigma Chemical Co., product nr. P8139 is recommended).
PMA
贮 存 液：PMA溶于DMSO，浓度为1mg/ml，-20℃保存
工 作 液：贮存液 1:4000稀释于无血清培养基中
此时为 250ng/ml
Calcium ionophore (ionomycin; Sigma Chemical Co, product nr. I0634 is recommended).
Ionomycin
贮 存 液：Ionomycin溶于DMSO，浓度为1mg/ml，-20℃保存
工 作 液：贮存液 1:200稀释于无血清培养基中
此时为 5μg/ml
50ml混合刺激剂＝PMA工作液12.5ul，Ionomycin工作液250ul，无血清培养基补齐
7. 10% 热灭活胎牛血清 (Hyclone cat# ALH14384 )
8. 抗原
设备:
• 洗板器: 自动或手动 (洗瓶, 手动分液器等)。
•专用CO2-细胞培养箱 (37°C)。
4°C冰箱
无菌间无菌操作台
Preparation kit reagents
1．包被用抗体
取50 μl加到10ml PBS中。（足够包被1块96孔板，100 μl/well）。
对10块板子， 500ul加到100ml PBS中
2．生物素标记的检测抗体（detector antibody）
取50μl加到10 ml Dilution buffer中。（混匀后加入ELISPOT板，100 μl/well）。
对10块板子， 500ul 加到100ml Dilution buffer(PBS+10%FBS)
3．STREP-HRP
取100μl加到10 ml Dilution buffer中。（混匀后加入ELISPOT板，100 μl/孔）。
对10块板子， 1ml 加到100ml Dilution buffer
4 显色激活系统（Activation system）
对于1块ELISPOT板，200ul AEC Chromogen + 10 ml AEC Substrate，混匀，10分钟内用完。（100 μl/孔）。
ELSPOT实验步骤
Day 1
包被ELISPOT板 16：30
1. 在ELISPOT板中每孔加入包被抗体100μl，4℃ 过夜。
Day 2
ELISPOT板的封闭 17：00
2. 取出已包被的ELISPOT板，吸弃每孔中的包被抗体溶液。
3. 用完全无血清培养基洗1次。
4. 在ELISPOT板中，每孔加入200μl完全无血清培养基。室温2h。(8道排枪)
5.
PBMC加入ELISPOT培养板 20：00
6. 取出封闭2h的ELISPOT板，吸弃每孔中的封闭液。(不要洗板！)
7. 在ELISPOT板中，先加30μl 无血清培养基(12道排枪)和20μl肽库(8道排枪)，后加50μl细胞(8道排枪) (每孔活细胞总数为2×105，每个病人需活细胞总数为10×106，体积为2.5 ml。每条多肽的终浓度为5μg/ml，活细胞的工作浓度为4×106/ml，活细胞的终浓度为2×106/ml）。
阳性孔中每孔加入50μl 细胞和30μl无血清培养基和20μl PMA+Inomysin（工作液浓度分别为250ng/ml和5ug/ml，终浓度分别为50ng/ml和1ug/ml）。
8. 用low evaporation lid 盖好ELISPOT板，放入37℃ CO2孵箱培养30 h。
注意：不要晃动ELISPOT板。
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Env1 |
Env1 |
Pol1 |
Pol1 |
Vif |
Vif |
Env1 |
Env1 |
Pol1 |
Pol1 |
Vif |
Vif |
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Env2 |
Env2 |
Pol2 |
Pol2 |
阴对 |
阴对 |
Env2 |
Env2 |
Pol2 |
Pol2 |
阴对 |
阴对 |
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样本 1
Env3 |
Env3 |
Pol3 |
Pol3 |
阴对 |
阴对 |
样本2
Env3 |
Env3 |
Pol3 |
Pol3 |
阴对 |
阴对 |
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Env4 |
Env4 |
Pol4 |
Pol4 |
阴对 |
阴对 |
Env4 |
Env4 |
Pol4 |
Pol4 |
阴对 |
阴对 |
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Env5 |
Env5 |
Pol5 |
Pol5 |
阴对 |
阴对 |
Env5 |
Env5 |
Pol5 |
Pol5 |
阴对 |
阴对 |
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Gag1 |
Gag1 |
Nef |
Nef |
阴对 |
阴对 |
Gag1 |
Gag1 |
Nef |
Nef |
阴对 |
阴对 |
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Gag2 |
Gag2 |
Tat
REV |
Tat
REV |
样本阳对 |
样本阳对 |
Gag2 |
Gag2 |
Tat
REV |
Tat
REV |
样本阳对 |
样本阳对 |
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Gag3 |
Gag3 |
Vpu
Vpr |
Vpu
Vpr |
样本阳对 |
样本阳对 |
Gag3 |
Gag3 |
Vpu
Vpr |
Vpu
Vpr |
样本阳对 |
样本阳对 |
Day 4
二抗和GABA标记，显色反应 8：30
9. 培养30h后，取出ELISPOT板，甩去细胞后。
10. 用去离子水洗涤2次。每次浸泡5分钟。
11. 用0.05％PBST洗涤3次。每次浸泡2分钟。
12. 每孔加入100μl 生物素化的detector Ab(8道排枪)。室温2小时。
13. 取出ELISPOT板，倒去detector Ab溶液，用PBST洗涤3次。每次浸泡2分钟
每孔加入100μl Strep-HRP溶液(8道排枪)。室温1小时
14. 取出ELISPOT板，倒去Strep-HRP溶液。
15. PBST洗涤4次。每次浸泡2分钟。
16. 用PBS洗涤2次。每次浸泡2分钟。
17. 洗涤完毕后，在吸水纸上轻轻拍干ELISPOT板。
每块板子200ul AEC Chromogen + 10 ml AEC Substrate，混匀，15分钟内用完。
18. 每孔加入100 µl 配好的substrate(8道排枪)。在暗处、室温下孵育（5～60分钟）。
出现斑点后，用自来水冲洗，中止反应。室温下干燥，检测。
