细菌感染性疾病的直接核酸诊断试验

                 Florence Paillard, PhD, and Craig S. Hill, PhD

准确和快速的诊断是及时采取治疗措施和防止感染性疾病扩散的关键。理想的感染性疾病的诊断试剂应该能够给临床医生提供快速、灵敏度高和特异性强的实验结果。检测试剂如果灵敏度不高则可能导致疾病的漏检，使患者不能得到及时的治疗，还可造成疾病的扩散；同样，试剂如果特异性较差则可能出现假阳性结果，假阳性的出现不仅会导致不必要的治疗，还可能给人们带来心理上的阴影。不论对个人还是公共卫生部门，因检测方法的不可靠所导致的错误诊断都有可能造成严重的后果。令人欣慰的是，近年来分子诊断技术的发展已使得人们可以研制出比传统方法更为灵敏、特异和快速的用于感染性疾病的诊断试剂。

一、细菌感染性疾病诊断方法述评

数十年来，检测细菌的的标准方法是培养（液体和/或固体培养基）和染色，如用于结核分枝杆菌的抗酸染色和淋病奈瑟菌的革兰染色。其它一些方法还包括采用抗体技术检测细菌抗原的酶免疫测定（EIA）和直接荧光抗体技术（DFA）等。

采用分子生物学技术检测微生物核酸成分的核酸检测（NATs）技术的发展为临床诊断方法带来了革命性的变化。目前用于微生物鉴定的NATs主要有两种类型：培养确认检测试剂和直接检测试剂。培养确认的NATs试剂主要用来对培养基上生长的微生物进行确认；直接NATs试剂可以直接检测标本中的微生物，无需培养。与培养确认探针试剂相比，由于直接NATs试剂完全不需要培养这一步骤，所以可以更快地给出检测结果；直接NATs试剂一般来说其准确性也高于直接免疫检测方法。美国FDA批准的第一个非放射性直接NATs试剂是Gen-Probe PACE试剂，用来检测衣原体和淋球菌感染。

对直接NATs试剂而言，一个至关重要的改进在于加入了目标扩增步骤，即探针检测前将目标序列进行扩增。第一个用于沙眼衣原体检测的核酸扩增试剂（NAATs）于1993年获得了FDA的批准。此后，随着核酸扩增技术的不断改进，出现了可以将样品成分的抑制作用降为最小的第二代NAATs，它的操作流程也得到了相应改进。

本文将就已经商品化并得到FDA批准的用于检测五种细菌感染的直接NATs试剂进行述评。这五种感染为：链球菌性咽炎、肺结核（TB）、阴道炎、衣原体（CT）和淋球菌（GC）感染。

二、直接NAT方法学

非扩增直接NATs（表1）：大多数商品化的直接NATs试剂都采用特异性针对出现在被测生物体内的一段独有的核酸序列（目标序列）的核酸探针。这种探针通常采用荧光或化学发光标记。所测样品需进行处理以使其能够释放出核酸。检测时，标记的DNA探针可以和靶序列特异性结合，形成一个稳定的探针-目标序列杂交体。该杂交体被从非杂交探针中分离或区别开后，标记物散发出信号。

在直接检测临床标本中的微生物时，NATs可以采用不同的方式来提高试剂的灵敏度。Gen-Probe采用的一项专利技术是将rRNA作为检测目标，rRNA在大多数微生物体内是以数以千计的拷贝量存在的。例如，沙眼衣原体中的rRNA可达2000拷贝，而DNA中有用的靶序列在每个细菌体内的量仅有一个或数个拷贝。因此以rRNA为检测目标可以大大提高试剂的灵敏度。除此之外，Gen-Probe由于在杂交检测中还采用了杂交保护检测（HPA）方法，使其试剂的灵敏度得以进一步提高。检测rRNA和HPA技术的结合使得第一个DNA探针检测试剂被临床实验室广泛用于培养的确定和直接检测。

第二个用于提高DNA探针检测灵敏度的方法是对信号分子进行放大，如杂交捕获试剂（Hybrid Capture assay）。它采用针对RNA:DNA杂交体的抗体来检测杂交形成，每个抗体都带有酶标记物。每个酶分子都会产生多种着色分子用于与之结合的每个杂交分子。这种从一个杂交分子产生多重信号分子的方法称为“信号放大”方法。但与第三种改进试剂性能的“目标扩增”方法相比，信号放大方法的灵敏度和特异性都要低的多。

目标扩增直接核酸扩增检测（表1）：目标扩增是指通过在一个试管内产生数百万个目标序列拷贝的方法来提高试剂的灵敏度，这种方法类似于通过培养使细菌体内产生更多的靶DNA或RNA拷贝以提高检测的灵敏度。但靶扩增的过程要比培养快的多，它可以用来检测实验室里难以培养或不能培养的细菌。目标扩增所采用的复制序列（亦称amplicons）为标记的DNA探针。目前广泛采用的鉴定细菌的几种目标扩增方法分别为PCR、链替代扩增（SDA）和转录介导扩增（TMA）。

1．PCR：指DNA目标序列受热变性，然后加入DNA聚合酶进行扩增的过程。可与目标序列特异性结合的引物引导DNA聚合酶对该序列进行复制。DNA合成的每个过程均经历加热变性—退火—延伸这样一个循环，每个循环后拷贝数可增加一倍。由于反应循环可进行一定次数，所以短时间内即可扩增获得大量目标DNA。

2．SDA：与PCR不同，SDA的扩增过程是在同一温度下进行的。这种“恒温”方法也需使用引物来保证扩增的DNA序列的特异性。不同的是，它无需采用加热变性的方法来解链双链DNA，而是采用限制性核酸内切酶对新合成的DNA引物进行切割。DNA聚合酶能识别切割位点并可以在该点重新启动DNA合成，通过对DNA的复制以替代以前的DNA链。这一过程可以使DNA的拷贝成倍增长，并循环进行。和PCR一样，SDA仅扩增DNA。如果扩增对象是RNA，则需首先将其转录为DNA。均相检测采用出现在SDA反应中的称之为“分子灯标”的一种特异性荧光探针，这种探针与扩增反应过程产生的复制序列（amplicon）进行杂交并改变其结构时会产生荧光信号。

3．TMA：TMA是在恒温过程中特异性扩增RNA或DNA分子，反应过程需引物和两种酶：逆转录酶（RT）和RNA聚合酶。逆转录酶用来合成DNA，合成的DNA再被RNA聚合酶用来复制更多的RNA，这一过程可以循环进行。采用自动化扩增仪，TMA可以在15到30分钟内使目标序列扩增100亿倍。检测采用HPA方法。HPA使用可以和复制序列进行特异性杂交的吖啶酯标记探针。扩增后，一种“选择试剂”可以破坏掉未杂交探针上的吖啶酯，而已经杂交的探针上的吖啶酯不会受影响，这是因为杂交结构可以保护它。检测可采用发光仪。

表1.用于细菌检测的商品化直接NAT技术

NAT类型        技术         核酸       标记        生产商

            杂交保护（HPA）  rRNA     化学发光     Gen-Probe Inc

非靶扩增    固相捕获          rRNA     比色         BD

            杂交捕获          DNA      化学发光     Digene Corp.

           

            PCR               DNA      比色        Roche

靶扩增      SDA               DNA      荧光        BD

            TMA              rRNA     化学发光    Gen-Probe Inc

三、直接NATs与培养/免疫方法的比较

（一）、与其它常用微生物检测方法相比，直接NATs的优势主要有：

1． 检测时间短（1—6小时）。虽然这一检测时间与EIA相似，但较之培养所需的24—72小时甚至8周（如结核杆菌）而言，还是有很显著的改进。快速检测不仅可以使病人得到及时治疗，在某些情况下，还能提高公共卫生的安全性（如避免疾病的扩散）。

2． 高通量检测。一些直接NATs可以在同一个时间里进行几百个标本的检测，不仅省时、也降低了成本。自动化的直接NATs也大大减轻了工作负担。

3． 高灵敏度NAATs。NAATs理论上可以从每份标本中检出一个生物体，而其它方法如EIA的最低检测水平为每份标本1000个以上的生物体。NAATs的临床灵敏度一般在95%以上，与标准培养方法相等或更敏感，在某些标本中更是明显（如尿标本CT检测）。

4． 因为无须要求被检测标本中的微生物一定是存活的，所以直接NATs对标本的要求不高。与培养相比，直接NATs所用的标本可以放置更长时间。

（二）、直接NATs的潜在局限性主要有：

1． 一些第一代NAATs在某种情况下会因为扩增抑制作用而导致试剂灵敏度的降低（如采用尿标本检测CT）。这种抑制作用通常是标本-特异的，会引起假阴性结果。通过内在监控或扩增控制等方法可以控制这种抑制作用，也可以采用目标捕获等技术处理标本从而消除抑制作用。尽管有时会出现抑制作用，但大多数NAATs临床检测灵敏度仍然高于非扩增的直接NATs或EIA。

2． 标本之间复制序列的残留物污染对NAATs可能是一个问题，但不影响非扩增直接NATs。严格执行操作程序可以最大限度的减少残留物污染所带来的影响。

3． 目前FDA批准的NAATs不能用于检测耐药性。对于需要了解耐药情况的一些病例如结核诊断，需同时进行NAAT和培养。NAATs可以快速检定结核杆菌，使患者得到及时治疗；而培养可以确定诊断及细菌耐药情况。

4． NAATs的成本通常高于传统微生物和EIA检测方法。一个例外是CT培养，它一般很难进行，而且成本要高于NAATs。

四、用于细菌感染性疾病的直接NATs（表2）

表２. FDA批准的用于细菌感染性疾病的直接NATs

病名　　　病原体　　　生产商/试剂　　 　 检测技术　　　所用标本（FDA认可）

　　A群链球　A群链球菌　　Gen-Probe/           HPA         咽拭子标本

菌性咽炎　　　　　　　　GASDirect

                             Roche/                           呼吸道标本

                             AMPLICOR MTB    PCR        （涂片阳性）

肺结核     结核杆菌     Gen-Probe/                        呼吸道标本

                        AMPLIFIED（MTD） TMA       （涂片阳性、阴性）

     

                                                     宫颈内拭子标本

                        Gen-Probe, PACE 2 CT  HPA      男性尿道拭子标本

                                                    眼结膜拭子标本

   衣原体感染  沙眼衣原体   Digene,Hybrid          Hybrid

                             Capture II CT         Capture    宫颈内拭子标本

                                                              宫颈内拭子标本

                             Roche,AMPLICOR CT  PCR      男性尿道拭子标本

                                                              男性和女性尿标本

                                                               宫颈内拭子标本

                                                                 男性尿道拭子标本

                              Gen-Probe,APTIMA Combo 2 TMA   男性和女性尿标本

                                                                 阴道拭子

                              Gen-Probe, PACE 2 GC  HPA       宫颈内拭子标本

                                                                男性尿道拭子标本

                               Digene,Hybrid          Hybrid     

                               Capture II GC          Capture    宫颈内拭子标本

                                                                 宫颈内拭子标本

                                Roche,AMPLICOR GC  PCR      男性尿道拭子标本

       淋球菌感染  淋病奈瑟菌                                    男性尿液

                                                                 宫颈内拭子标本

                                BDProbe Tec ET CT/GC   SDA    男性尿道拭子标本

                                                                 男性和女性尿标本

                                                                 宫颈内拭子标本

                                Gen-Probe,APTIMA Combo 2 TMA  男性尿道拭子标本

                                                                  男性和女性尿标本

                                                                  阴道拭子

                  阴道加特纳菌、

       阴道炎     阴道毛滴虫、   BD Affirm VPIII            固相   阴道拭子

                  念珠菌属                                  捕获

    A群链球菌性咽炎：检测咽炎病人A群链球菌（GAS）的金标准是采用咽拭子标本进行培养，但培养需要24—48小时。目前所开发的快速抗原检测试剂（RADT）虽然可以进行快速检测，而且使用也较方便，但其灵敏度一般比培养低。许多专家建议当病人为儿童或青少年、或医生在他的实际工作中不能确定所使用的RADT的灵敏度是否和培养相同时，则应当采用咽拭子培养对所有RADT检测阴性的标本进行确定。

Gen-Probe公司生产的GASDirect试剂（表2）是目前唯一通过FDA认可的用于检测GAS的直接NAT试剂。它采用HPA方法测定GAS的rRNA序列。GASDirect的灵敏度约为90%、特异性≥98%，优于RADT试剂，与培养的灵敏度相似。GASDirect的检测时间为60分钟，每份标本的检测成本低于咽拭子培养，与RADT相同。因此，在GAS的检测方法中，GASDirect不失为一个有用的选择。

肺结核（TB）：目前美国胸科学会和CDC对TB的实验室检测要求是荧光抗酸染色（AFB涂片）和液体及固体培养基培养。涂片比较快捷但灵敏度较低；培养的灵敏度较高但需2到8周。Gen-Probe公司生产的AMPLIFIED结核分枝杆菌检测试剂（MTD、第一个由FDA批准的结核NAAT检测试剂）和Roche公司的AMPLICOR MTB试剂（表2）已被用于TB的诊断。不过这两种试剂被限定只能用于呼吸道标本的检测。它们可以用做TB的初期诊断，但不能用于监控治疗。

    与培养或最终确诊结果相比，上述方法的灵敏度和特异性与培养相似，但这些商品化的NAAT试剂的检测时间只需一天，因此可以为医生提供快速诊断结果。FDA早期批准的NAAT试剂仅用于AFB涂片阳性的病人，而后来批准的MTD试剂可以用来对涂片阴性的可疑TB患者进行检测。MTD这一用途使其能够对标本中结核杆菌数量很少而难以采用涂片检查的病人进行快速检测。图1概述了CDC推荐的采用MTD检测结核分枝杆菌的使用原则。

图1. 用于可疑TB患者的MTD检测使用原则

        第一份痰标本 → 培养 → 确定或否定TB诊断

         ↓      ↓

        涂片   NAAT

         ↓      ↓

        阳性    阳性 → MTB阳性

        阳性    阴性 → 检查有无抑制作用 → 无 → 检测其它标本 → 涂片（+）MTD（–）→NTM

                                         → 有 → 采用MTD或其它NAAT检测其它标本

        阴性    阳性 → 检测其它标本 → MTD（+）→ MTB阳性

        阴性    阴性 → 检测其它标本 → 涂片（–）MTD（–）→ MTB阴性

       

        注：NTM：非结核分枝杆菌。

阴道炎：与阴道炎有关的微生物包括阴道加特纳菌、阴道毛滴虫和念珠菌属。传统诊断阴道炎的方法为阴道标本培养和玻片镜检。培养虽然灵敏，但耗时、耗力，且成本较高；玻片镜检比较快捷，但对某些病原体的灵敏度较低（如检测念珠菌和滴虫的灵敏度≤55%），且检测结果的准确性常常依靠操作人员的经验。BD公司的Affirm VPIII检测试剂（表2）是一种NAT试剂，采用两个探针：一个是捕获探针，一个为检测探针。靶序列首先与固定在一个珠子上的捕获探针进行杂交，然后再与检测探针杂交。随后经洗涤去除未结合的标本和探针，将检测探针与检测酶结合。通过几次洗涤将多余的酶去除后再加入酶底物，结果呈蓝色，可通过肉眼观察。Affirm VPIII能检测上述三种病原体，与培养相比，其灵敏度分别为：念珠菌81%、加特纳菌89%、毛滴虫92%。

衣原体（CT）和淋球菌（GC）感染：检测CT和GC的实验室方法目前主要包括革兰染色、培养、非扩增NATs、NAATs、EIA和DFA。

1．非扩增NATs：Gen-Probe公司生产的检测CT、GC或联检DNA探针试剂（PACE 2 CT、PACE 2 GC或PACE 2C）已获得FDA的批准，可用来检测来自宫颈内、男性尿道和眼结膜（仅供CT）的标本。使用一份拭子标本，PACE2就可以对CT和GC进行联检（PACE 2C）或检测其中的一种。目前在美国PACE2系列已成为临床实验室最为常用的检测CT和GC的方法。PACE 2采用HPA方法测定rRNA，灵敏度和特异性与培养相似；PACE 2 GC的灵敏度与NAATs相似，但PACE 2 CT的灵敏度低于NAATs（表３）。

表３.　４种FDA批准的检测CT直接NATs对比

　　试剂　　　　　　技术　　靶序列　　拭子标本的灵敏度　　尿标本的灵敏度

　Gen-Probe PACE 2 CT　HPA　　rRNA　　　70%--90%            不适用

　Roche AMPLICOR CT  PCR    DNA       >90%                80%--90%

  BD Probe Tec CT/GC    SDA    DNA       >90%                80%--90%

  Gen-Probe APTIMA

   Combo 2 CT/GC        TMA   rRNA      >95%                >90%

2．NAATs：Roche公司的AMPLICOR试剂是第一代基于PCR的NAAT；而BD公司的BDProbe Tec是第一代基于SDA的NAAT。这些试剂扩增的目标序列通常位于染色体DNA或质粒中。BDProbe Tec目前有两种：一是检测CT的BDProbe Tec CT，另一种是可以在一份标本中同时检测CT和GC的BDProbe Tec CT/GC。新近出现的CT/GC NAAT是Gen-Probe公司的Combo 2试剂，它是基于TMA的第二代NAAT，通过在一份标本中同时扩增CT和GC的rRNA分子而对二者进行检测和确定。这种试剂采用一种独特的目标捕获方法对目标分子进行纯化和浓缩以去除可能存在于标本内的抑制物。目标捕获方法采用特异性探针将目标rRNA分子结合到磁微粒上，未结合的分子经洗涤除去。随后已经过纯化和浓缩后的目标分子通过TMA进行扩增。

3．检测CT和GC的直接NATs的灵敏度和特异性：检测CT的NAATs通常比非扩增的NATs和CT培养的灵敏度高，而检测GC的NAATs的灵敏度与培养和非扩增的NATs相似。采用拭子标本的所有检测CT的NAATs一般都有较高的灵敏度(>90%)，其中Combo 2试剂的灵敏度最高（>90%）。

对于泌尿生殖道标本，PACE 2试剂盒被批准只可采用男性尿道和女性宫颈内拭子标本检测CT和GC。而NAATs不仅可以采用拭子标本、也可使用尿液标本。由于尿的采集是非侵入性的，易于被病人接受，同时也减轻了工作负担。由于高水平抑制物质的存在，采用尿标本的第一代NAATs的灵敏度比采用拭子标本低5-10%，这点在女性更为明显。采用PCR方法（如AMPLICOR试剂）检测女性尿标本中GC的效果尚不清楚。SDA方法已获批准可以采用男性和女性尿标本进行检测，但女性尿标本检测灵敏度比宫颈内拭子标本低大约10%。Combo 2靶捕获方法可以减少抑制，因此采用该试剂检测尿标本的灵敏度高达91%-100%。

CDC最近发表了CT和GC检测指南（表4）。NAATs因其高灵敏度被推荐用于CT检测，但也可采用探针检测和EIA方法。对于GC检测应首选拭子标本培养，因其具有很高的灵敏度，并能进行药敏检测。NAATs和探针检测的灵敏度与GC培养相似，当因转送和储存条件不佳难以进行培养时推荐采用NAATs和探针检测。不论CT还是GC感染，所有检测方法均推荐采用男性尿道和女性宫颈内拭子标本。如果侵入性的拭子采集方法不被接受或不能采集，NAATs可采用尿标本。由于交叉污染或某些第一代NAATs可以和非淋病奈瑟菌发生非特异性反应，CDC建议核查一些阳性结果以排除假阳性。在低流行人群中，对CT/GC NAAT结果阳性者应进行附加NAAT检测以排除可能出现的假阳性结果，避免给患者带来不良影响。阳性结果的确认应采用不同的NAAT或采用技术相同但扩增不同CT/GC序列的NAAT，以帮助排除假阳性结果。

表４.　 CDC推荐筛查男女CT和GC感染的检测方法

　　　病原体　　　　　　　　　检测方法

　　　　　　　　　　　　　　采用拭子或尿标本的NAAT

　　　　　　　　　　　　　　采用拭子标本的非扩增NAT、EIA

　　　　　衣原体（CT）　　 或DFA

　　　　　　                拭子培养

                            拭子培养

　　　　　淋球菌（GC）     采用拭子标本的NAAT

                            或非扩增NAT

                            采用尿标本的NAAT

五、直接NATs的未来发展趋势

提升自动化程度使操作更容易是直接NATs的未来发展趋势之一。现行的直接NAT仪器大多只能自动化操作检测过程中的一部分（如扩增或测定）。新的全自动仪器如TIGRIS DTS（Gen-Probe公司）可以自动化完成所有检测步骤，每12小时最多可进行1000个测试。

一些以往采用繁杂、冗长检测方法的NAATs正开始使用测定扩增反应中产生的复制序列的探针（实时检测）。实时扩增技术尤其适用于定量检测。

多元化检测也是未来发展的一个方向，它可以用一项检测来测定多个病原体。相信扩增技术、生物芯片和微流体技术的应用最终能够使我们采用一项检测、用一份标本来检测多个不同的病原体，不仅快捷、而且具有良好的性价比。

六、结论

直接NATs代表了检测细菌感染的诊断方法上的一项突破。快捷、精确、采用标本灵活使得直接NATs在临床实验室的用量持续增长。在诸如CT感染等多种细菌感染的诊断中，直接NATs正在越来越多地替代培养和其它常规方法。在ＴＢ的诊断中，由于需要区分不同的分枝杆菌和测定药敏，所以NAATs还不能完全取代培养，但NAATs和培养可以取长补短、联合用在ＴＢ的诊断中。用于分枝杆菌的NAATs的未来发展包括检测不同分枝杆菌的多元化测定和药敏测定。更新一代的直接NATs也正在研发中。

　　七、参考文献（略）

作者简介：Florence Paillard, PhD，美国科学和医学专业作家；Craig S. Hill, PhD，美国Gen-Probe公司科学事物主管。