膜片钳技术的应用进展
膜片钳技术的应用进展
作者：田晶 作者单位：吉林医药学院生理学教研室，吉林 吉林 132013
【摘要】 膜片钳技术是研究离子通道的“金标准”，应用该技术可以证实细胞膜上离子通道的存在，并能对其电生理特性、分子结构、药物作用机制等进行深入的研究。
【关键词】 膜片钳技术 离子通道 进展
1976年由德国马普生物物理化学研究所的Neher和Sakamann首次报道了应用膜片钳技术在蛙胸皮肌细胞膜上记录到单通道电流［1］。在以后的5 年中，膜片钳技术不断完善。自1981年以来，该技术已经在不同动物的肝、脾、胃肠、心肌、骨骼肌、神经系统、内分泌等各类细胞上应用并取得了研究成果［2］。膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，与基因克隆技术(gene cloning)并驾齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。
1 膜片钳术的原理
膜片钳技术是用微玻管电极（尖端直径约1～5 μm）接触细胞膜而不刺入，然后在微电极另一端开口施加适当的负压，将与电极尖端接触的那一小片膜轻度吸人电极尖端的纤细开口，这样在这小片膜周边与微电极开口处的玻璃边沿之间，会形成紧密的封接（gigaohm seal），在理想的情况下其电阻可达数个或数十个千兆欧姆(l09Ω)以上的阻抗封接，使与电极尖开口处相连的细胞膜的小区域（膜片）与其周围的细胞膜 在电学上完全分隔，如果在这一小片膜中只包含了一个或少数几个通道蛋白质分子，那么通过此微电极就可测出单一通道开放时的离子电流和电导，并能对单通道的其他功能特性进行分析。
2 膜片钳主要技术操作
2.1 实验所需仪器
随着计算机软硬件技术的发展，出现了容数据记录、采集、处理功能于一身的硬件软件系统，简化了膜片钳技术的操作及分析。实验仪器包括膜片钳放大器，信号采集器，三维液压操纵器，显微镜，给药系统，细胞动态呈像及摄像系统等。
2.2 实验标本制备
膜片钳实验采用的标本可以是培养的细胞，也可以是急性分离的细胞。因为细胞分离技术简单、快速、实用，分离出的细胞可以基本满足实验的要求，所以多用后者。不同实验室已经用从大鼠、豚鼠、兔、狗、猪、羊、雪貂等动物制作的细胞标本进行了大量的研究。近年也有学者在神经细胞实验中用振动切片将组织制成超薄 片作为标本，这样能保持神经细胞在体发育的程序及空间结构，有相对完整的突触联系。此外神经元没有受到消化酶的破坏，细胞生物活性接近生理状态。而且，现在出现了双探头膜片钳放大器可以做双细胞记录，观察细胞间通道的动态联系［3］。
2.3 实验的一般操作步骤
①拉制微电极和充灌微电极；②将预先处理的实验标本置于显微镜载物台上的灌流槽内；③于显微镜低倍镜下，用微操纵器将电极移动到浴液上方，换用高倍镜按一 定标准选择合适的细胞，然后接近靶细胞或组织，完成电极与标本的封接；④给予钳位电压或电流等指令条件并分别记录电流、电压等参数；⑤对电流等性质分析后，施加不同的药物记录并分析电流等参数。
2.4 实验数据的记录与分析
膜片钳实验记录的离子通道电流是一连串近似矩形的脉冲信号。在通道开放期间，信号的形态复杂多样，有时是多个矩形波单位幅值簇状发放（burst），有时 有短暂的间隔，时而有簇状串（cluster）等，表示离子穿越通道的过程并非全部线性连续而富含非线性过程。通道的开放时程是随机变化的指数形式分布。用指数和的分布，求取平均开放时间才能更精确地描述通道的活动，往往需要成百上千个通道电流数据，这样庞大的分析工作必须借助于计算机完成。
3 膜片钳实验的常用工作模式
3.1 细胞吸附式膜片
细胞吸附式膜片（cell attached patch） 是膜片钳的基本方式，其它方式由此衍生。这种膜片形式比较稳定，因细胞骨架及有关代谢过程是完整的，故对细胞结构和环境干扰最小。但这种膜片形式易在电极尖端形成囊泡，从而细胞骨架可能有所变化。另外这种膜片不能控制细胞内成分。且任何影响膜电位的处理均可影响其电位水平。
3.2 内面向外式膜片
内面向外式膜片（inside out patch）细胞内外和电极内的溶液均可调控，既能较容易地改变细胞内的离子或物质浓度，又能把酶等直接加于膜的内侧面，适宜研究胞内物质对通道活动的影响。但实验中难以改变膜外侧物质，且需浸于低钙液中。常用于研究依赖细胞内钙的离子通道，如钙敏感的钾通道，还可用于细胞内激素和第二信使与通道的调节作用。
3.3 外面向外式膜片
外面向外式膜片（outside out patch） 能接触膜的两侧，可以任意改变膜外物质的浓度，有利于研究离子、递质对膜外表面的作用，多用于研究细胞膜外侧受体控制的离子通道。这些受体直接作用于离子通道，而不需经过第二信使系统。因细胞外液容易更换，故加药方便。缺陷是实验中难以改变胞内成分，而且电极管内必须充以低钙液。
3.4 全细胞式膜片
全细胞式膜片（whole cell patch）方式使细胞内与浴槽之间的漏流极少。电极本身阻抗（1～ 10 MΩ）与细胞封接后的阻抗相比较低，这种低接触阻抗使单管电压钳容易实现。电极管内与细胞之间弥散交换与平衡快，因而容易控制细胞内液的成分。细胞钳记录的是许多通道的平均电流，有利于综合分析。如果有目的地将膜电位钳制在某一程度，可做到选择性抑制某些通道的活性而只记录某种通道电流的总和，并可在同一 细胞上观察几种不同通道的情况。通过改变内部介质，如改变电极液成分，或在电极液中加入所需药物，通过渗透很快改变胞浆成分并达到平衡，该手段在全细胞记录中广泛应用。它适合于小细胞的电压钳位，对于直径大于30 μm的细胞很难实现钳位。不足之处是由于电极与细胞间交换快，细胞内环境很容易破坏，因此记录所用的电极液应与胞浆主要成分相同，如高K+，低Na+ 和Ca 2+及一定的缓冲成分和能量代谢所需的物质。
3.5 穿孔膜片
穿孔膜片 (perforated patch) 是为克服常规全细胞模式的胞质渗漏问题，有学者将与离子亲和的制霉菌素或二性霉素B经微电极灌流到含有类甾醇的细胞膜上，形成只允许一价离子通过的孔，用此法在膜片上做很多导电性孔道，借此对全细胞膜电流进行记录。由于此模式的胞质渗漏极为缓慢，局部串联阻抗较常规全细胞模式高，所以钳制速度很慢，也称为 缓慢全细胞模式。
4 膜片钳技术的主要用途
膜片钳技术广泛用于研究细胞离子通道，已经成为研究细胞水平生理功能的常用技术。归纳其主要用途包括［4］ ：1）可分辨单通道电流，直接观察通道开启和关 闭的全过程。通过测得的单通道特征参数可鉴别通道类型，同时可验证和研究通道的开关动力学模型。2）单通道记录可以解释某些药物的作用机制，以研究特定药 物对电压和递质依赖通道的影响。3）膜片钳的空间分辨率高，在中枢神经系统中可分离细胞体与轴突和树突的电流；在周围神经系统中可深入了解受体的分布区域，绘制细胞表面的特定离子通道的分布图。4）“内面向外”和“外面向内”膜片记录允许任意改变膜片内外溶液成分，分别研究单一组分对通道特征的影响，避免了其他成分的干扰。而全膜片记录可用来研究常规电压钳无法研究的小型细胞，在控制细胞内一定离子浓度的同时监测整个细胞膜的电活动。这种方法已被用于采 用重组DNA技术表达的通道研究。5）膜片钳技术还可用于研究第二信使的作用。
5 膜片钳技术的扩展应用与展望
膜片钳技术与其它技术相结合，使其应用不断扩展。1991年Eberwine和Yeh 等首先将膜片钳技术与PCR 技术结合起来运用，其具体方法是：用全细胞膜片钳记录培养细胞或制备脑片的生物物理学和药理学特征，然后将细胞胞浆内容物收集入膜片微吸管尖内，再把胞浆 RAN反转录成cDNA，然后用PCR直接扩增，PCR的产物通过凝胶电泳和DNA序列进行分析。这两项技术的结合可对形态相似、而电活动不同的细胞做出分子水平的解释［5］ 。这样在观察电生理功能的同时，分析有关基因表达改变的情况，成功地实现了在单个细胞内同时研究功能与分子的变化。
通过克隆通道基因转染靶细胞的方法，已能进行通道分类并将与人类有关的通道基因克隆表达，如对KATP异源同构的研究；并用膜片钳记录通道的动力学特性， 增加了对通道结构与功能的认识，例如发现病理和非病理状态下，因通道基因表达的不同而有不同的电生理学特性。分子生物学的发现认为通道的基因表达处于变化之中，不同状态（如发育，疾病）会带来相应的电变化或电重塑［6］ 。
膜片钳技术结合Indo1、Fluro2和Fluro3等荧光探针法测定胞内钙浓度，可研究钙内流和胞内钙释放的情况。用放射配体氚即3H结合技术 与膜片钳技术结合，可以检测异丙酚与通道的结合位点［7］ 。另外，Nygren等［8］ 和Priebe等［9］ 用膜片钳实验结合数学模型的方法描述人心房 和心室肌细胞通道特性，并可对特殊状态下心肌的通道变化做出预测。
总之膜片钳技术以其实用、快速、灵敏、准确及重复性好等技术优势已经在大量的研究中得到证实。膜片钳技术为从分子水平了解生物膜离子通道的门控动力学特征及通透性、选择性等膜信息，提供了最直接的手段，使人们对细胞膜通道功能的认识进入了一个崭新的阶段。膜片钳技术与其它技术结合必将继续为生命科学的发展 做出巨大贡献。
【参考文献】
［1］ Neher E,Sakmann B.Singlechannel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres［J］.Nature，1976，260(5554):799802.
［2］ Korneich B G.The patch clamp technique:principles and technical considerations［J］.J Vet Cardiol，2007，9(1):2537.
［3］ Yamazaki Y,Kato H.Modulatory effects of periinterneuronal glial cells on neuronal activities［J］.Brain Nerve，2007，59(7):689695.
［4］ 马力农.细胞膜离子通道及其检测技术的研究进展［J］.深圳职业技术学院学报，2003，2（3）：2126.
［5］ 赖仞，查宏光，张云.动物离子通道毒素与药物开发［J］.动物学研究，2000，21（6）：499506.
［6］ 黄兵，陈雷.膜片钳技术在心肌细胞药理效应研究中的应用［J］.中国药学杂志，2002，379（6）：406409.
［7］ Zhou W G,Fontenot J,Liu S,et al.Modulation of cardiac calcium channels by propofol［J］.Anesthesiology，1997，86 (3):670675.
［8］ Nygren A,Fiset C,Firek L,et al.Mathematical model of an adult human atrial cell:the role of K+ currents in repolarization［J］.Circ Res,1998，82(1):6381.
［9］ Priebe L,Beuckelmann D J.Simulation study of cellular electric properties in heart failure［J］.Circ Res,1998，82(11):12061223.
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