分子克隆 蛋白表达实验指南-Molecular Cloning &protein expression
目的基因克隆包括保存用全长基因(gene for saving, GS)和表达用全长基因(gene for expression, GE)两部分。
这两部分所克隆的基因都是全长片段，但克隆的策略及目的不同。直接用精确克隆(及引物从基因CDS两端开始)很难找到高效价的引物，且cDNA中目的基因很少，成功克隆出基因很困难。因此我们选择在CDS两端设计高效价引物，先将基因从cDNA文库中克隆，将克隆插入T载体中。之后再设计一对用于精确克隆的引物，以插入目的基因的重组T载体为模板，克隆出用于表达的基因，插入T载体。GS目的基因的拷贝数很高，及时引物效价不高，仍然能获得GE。
全长基因难以获得时(如GC含量较高)，可克隆目的基因中800～1000bp的片段用于表达。
1． 细胞复苏及培养
a． 确定细胞复苏用得培养液。培养液使用前37C水浴温育。
b． 预先准备10ml的相应培养液，用于洗涤复苏细胞
c． 从液氮中取出cell后，37C温育至融化。开盖前用酒精消毒
d． 用移液管将复苏细胞转入step b中的培养液中洗涤，除去冻存cell中的DMSO
e． 1000rpm，5min，去上清，轻轻振荡重悬cell，加入1ml左右新培养液，混匀
f． 转移cell至含20ml左右培养液的培养瓶中，盖口不能拧紧，37C培养至培养瓶壁贴满cell
g． 培养约2－3天至细胞贴满培养瓶壁时将细胞传代，分装两个培养瓶，一个保种，一个抽RNA。
2． RNA抽提
悬浮细胞 组织器官 单层贴壁细胞
（5-10X106） (50-100mg) 107
1000rpm，5min离心 匀浆 胰酶消化至细胞悬浮，1000rpm，5min离心
PBS洗涤两次(PBS无须DEPC处理)，
1mlTRI REAGENT 裂解，用枪吹打混匀，室温5min
可-20度保存留用，or
200ul 氯仿（剧烈摇匀vortex，室温5min,ice 5 min）
12000g 15min 4℃
取水相（500ul以上）加入等体积异丙醇(室温5min,ice 5min)
加完异丙醇立即上下颠倒5－10次混匀，若同时抽多管，则每次加完一管后都应立即混匀
12000g 15min 4℃
倾倒除去上清，并用枪吸干
1ml 75%乙醇 wash一次，用枪吹打均匀
7500g， 5 min 4℃
去上清，尽量用枪吸尽
air dry the RNA pellet ,2～3min
do not let RNA turn translucent
50 ul ddH2O (DEPC treated) dissolve by a pipet
检测O.D值/1% agsrose 电泳
RNA分装成10ul后冻存，防止反复冻融使RNA降解。取RNA时一定带上手套，避免手上的RNA酶污染。
抽提RNA后应跑核酸电泳检测RNA纯度及降解程度。一般RNA抽提后应在700bp～1.5kb范围内有两条清晰的带。
3． Reverse Transcription
System（40ul）
5X buffer 8ul
0.1M DTT 4ul
dNTPs(10mM) 8ul
RNAse inhibitor 0.5ul
Superscriptase 1ul
Oligo（dT）12-16 (0.5ug/ul) 1 ul
Sample RNA (4ug) 4ug
DEPC H2O add to 40ul
将Oligo
dT与RNA，DEPC水混匀后，70C水浴10min(封口)，冰浴2-3min，加入其余上述混合液，37C水浴1.5h，95C水浴5min(封口)，冰浴，-20C
store。RT-PCR水浴时封口膜封EP管，防止水蒸发影响反应体系。
RT-PCR后用持家基因HPRT引物PCR，检测RNA抽提质量。HPRT退火温度60C左右。HPRT长度较小，为与引物二聚体区别，PCR时需做一不加模板的空白对照
取DEPC水时切记带上手套
Genequant使用方法：
开机－set-up－enter(只更改DNA/RNA，看光波是否为320nm)－set-ref(此时插入空白对照)－样品
1．使用前将比色皿中水吸出，用1ml蒸馏水重新洗涤再将比色皿中的水吸尽（先用1ml枪吸，后用100ul枪吸）。
2．加80ul水测对照
3．2ul RNA稀释40倍测浓度
4．测完后看RNA浓度（conc键），ratio值（ratio键）
4． 引物设计
利用VectorSuite NTI设计目的基因引物(克隆产物用于保存时，引物不用加酶切位点；用于表达蛋白时，引物两端须加上相应的酶切位点)
引物设计注意事项：
a． 所设计引物的rating值最好为171，两个引物的Tm值不能相差太大，最好在1C之内。Tm值应在50－70C之间，不能太小。
b． 设计好后，用NTI选择引物二聚体较少的primer，dimer最多不能超过8对。
c． 将NTI软件中的所有酶切位点全部加入。系统默认的酶切位点很少。
d． 目的基因片断中不能包含引物两端的酶切位点。
e． 酶切位点两端应加对应的保护碱基。
f． 对照相应的载体核对阅读框是否正确。注意载体a,b,c亚型ORF的区别。
g． 选择普遍表达、实验室有相关cDNA的基因或基因亚型。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed
h． 当表达载体的tag在C端时要注意插入片段后对tag读码框的影响。如his tag，要防止它因为读码框改变而变成Pro或Thr。
i． 核对读码框，保证质粒插入片断后不影响其MCS后面的终止子ORF，使融合蛋白能够有效的终止。
j． 目的片断的GC含量不能超过70%，最好65%以下。高GC值片断PCR不易成功
k． 3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。3’最好以G或C 结尾，防止AT 的松散结合引起错配
每条引物合成2OD（1OD约为33µg）
引物稀释
每个引物稀释成10µmol/ml
所加水量＝3.3*10e6/MW µl
5． PCR
PCR退火用不带酶切位点和保护碱基那一段引物的退火温度。该温度可以用Vecter
NTI查询。用梯度PCR仪进行不同退火温度条件摸索。一般变动范围为8C即可。
Taq PCR摸复性温度
System(30µl):
10*reaction buffer(for Taq enzyme) 3µl
MgCl2 1.8µl
dNTP 1.5µl
primers As 1µl
Sp 1µl
cDNA 0.5µl
ddH2O 21µl
Taq 0.2µl
体系中cDNA和primers的量可以根据实际情况进行调整。如：PCR不能拉出产物时可以增加cDNA量至1µl。
若有非特异性条带，可进行Touchdown PCR，提高引物的特异性。
PCR反应条件：
1 94C 5min
2 94C 45s
3 65C 45s 退火温度视不同引物而定，此处65C仅作例证
4 72C 1min go to step 2; 30 cycle
5 72C 7min
6 4C x min 该步视情况而定，若PCR过夜则x=12h
step4的1min视基因长度而定，Taq DNA polymerase合成效率为2kb/min。
Taq PCR摸索好退火温度和延伸时间等后进行Pfu PCR。Pfu DNA合成效率比Taq酶（2000bp/min）低，因此Pfu
PCR的延伸时间比Taq PCR适当延长20s。
电泳验证后进行Pfu PCR
System(30µl):
10*reaction buffer(for Pfu enzyme) 3µl
dNTP 1.2µl
primers As 0.6µl
Sp 0.6µl
cDNA 0.5µl
ddH2O 23.3µl
Pfu 0.3
做四个30µl体系，以便进行胶回收。
关于PCR更多的问题可以参照附件中有关PCR的综述。
6． 胶回收（使用前检查kit里的Washing buffer是否已加无水乙醇，预开55－65度水浴）
采用上海申能博彩生物技术有限公司的DNA凝胶回收试剂盒，操作步骤如下：
A 紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶,计算凝胶重量。
B 每100mg胶加400ul的SN solution,于55-65C加热，间断混合，直至凝胶块完全熔化（约6-8min）。
C 每400ul的SN solution加入100ul的solutionB，混匀。
D 把混合液加入3S柱（DNA收集柱），室温放置2分钟后，10000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的液体。
E 向3S柱中加入600ul Wash solution, 10000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的液体。
F 重复e step
G 10000rpm离心2分钟，尽量取出液体，倒掉收集管中的液体。
H 将3S柱置于干净的1.5ml的EP管中，在3S柱的膜中央加入30ul预热的TE solution,
55-65。C水浴放置2分钟（可在水浴锅中加盖放置，提高洗脱效率），15000rpm离心1分钟。－20。C保存。为了提高洗脱的效率，可先用20ul洗脱，然后再重复用10－20ulTE洗脱。洗脱步骤相同。
胶回收时尽量用较少的TE洗脱(15ul)，提高胶回收产物的浓度。或DNA电泳时上样量增加也可获得相同效果。
PS：胶回收产物与载体连接时，决定连接效率的主要是胶回收产物的浓度。载体的含量可相对降低
7. PCR产物与TA载体连接
pGEM-T vector is T-tailed at the insert site. To improve the ligation
efficiency, it is recommended PCR product be A-tailed.
+A system
Purified PCR product 6.1ul
dATP(1mM) 2ul
10×Taq buffer 1ul
MgCl2 0.6ul
Taq 0.3ul
vortex, then incubate at 70C for 15~30min
Ligation with pGEM-T vector
1. Briefly centrifuge the pGEM-T and Control Insert DNA tubes to collect
contents at the bottom of the tubes.
2. Set up ligation reactions as described below. Note: Use 0.5ml tubes known
to have low DNA-binding capacity (e.g., VWR Cat.# 20170-310).
3. Vortex the 2X Rapid Ligation Buffer vigorously before each use.
Ligation System
2×rapid reaction buffer 5ul
pGEM-T vector 0.5ul
+A product 3.5ul
T4 DNA ligase 1ul
Vortex, then incubate at 25C for 1h. Ligation product can be use
directly for transformation or store at -20C
连接温度及时间：TA载体可快速连接，2h即可，25C，也可4C过夜。表达载体连接16C 3h后即可转化，或4C/16C连接过夜。
Transformation and selection of the target clone
a. 取出感受态菌室温放置至半融状态。
b. 加入5μl质粒(若为连接产物，取5ul转化；若为纯质粒，取1ul转化)，轻搅至混匀。冰浴30分钟。
c. 42℃热休克45－50s，注意热休克时不能搅拌或振动。
d. 冰上放置2－3min。
e. 加入500μl 无抗生素 LB液体培养基，37℃摇床培养30min。
f.
取菌液300μl涂平板，37℃倒置培养12－16h。(如是纯质粒转化，取50ul涂板即可；如是连接产物转化，可10000rpm离心后，留100ul上清取50-100ul涂板)
Transformation efficiency of TA vector is relatively higher than that of
double-enzyme-digestion ligation. So 100ul LB after incubation should be
enough to spread on the plate.
100µl of 100mM IPTG and 20µl of 50mg/ml X-Gal may be spread over the surface
of anLB ampicillin plate and allowed to absorb for 30 minutes at 37°C prior to
use. Spread IPTG first on the plate, then X-Gal. There will be precipitates,
If mix the two in a tube.
For TA clone, after incubate at 37C overnight, place the plate in 4C for 2~5h
to identify the target clone.
Successful cloning of an insert in the pGEM-T Vector interrupts the coding
sequence of β-galactosidase; recombinant clones can usually be identified by
color screening on indicator plates. Those inserted clones are white, the
others blue.
8. TA质粒转化菌落的验证
与表达载体的验证不同，转化TA质粒时不用双酶切验证。只需用目的基因引物和TA载体引物PCR验证即可。TA载体引物PCR片段比插入片段大约长150bp。
目的基因退火温度与之前胶回收时温度相同，TA退火温度60C即可，但可在55～70之间变动，不会影响结果。
挑取至少6个白色克隆于6个含4ml抗性的LB培养基的灭菌试管中37C过夜摇菌。
取摇约2h时的菌液1ul作为模板，Taq
PCR（30ul）验证（验证时条件等应与以前一致）。取菌液时应在超净台中进行，以便PCR验证为阳性后可以直接对相应的菌落进行小量质粒抽提。最好不用菌落直接PCR，避免由于质粒粘附在细菌表面而引起的假阳性。对PCR验证后阳性的细菌小抽
验证时所用的control及样品：
1．白色菌落T载体引物PCR
2．白色菌落目的基因引物PCR
3．蓝色菌落T载体引物
4．1中T载体引物PCR、胶回收后，用回收产物做模板，目的基因为引物PCR，进一步验证
9．小量质粒抽提
采用上海博采生物工程有限公司提供的小量质粒快速抽提试剂盒，操作步骤如下：
1．取菌液1.5ml，高速离心10000g 1min 收集菌体。可以在初次离心后弃上清再加入相同的菌液，增加小抽的细菌数量，提高最终质粒的浓度。
2．弃上清，沉淀中加入100ul S1，振荡至彻底悬浮。
3．加200ul
S2，立即上下颠倒，使细菌裂解，室温放置2min至溶液澄清。（使用前先观察S2中是否有沉淀，室温低时S2中SDS会沉淀，此时40C水浴使之融解）
4．加400ul S3，立即上下颠倒5－10次，使充分中和，室温放置2min。
5．15000rpm，10min
6．将上清转移到2ml样品收集管和3S柱中，室温放置2min，10000rpm，1min。转移上清时切忌吸取蛋白沉淀。
7．取下3S柱，弃废液，将3S柱置入同一支收集管中，吸取700ul Wash Solution到3S柱，12000rpm，1min。（用Washing
Solution前先确认其是否加了乙醇，不加乙醇的WS会将质粒洗脱）
8．重复step7
9．取下3S柱，弃废液，10000rpm，1min。
10．将3S柱置于干净的1.5ml离心管中，在膜中央加30-50ul
TE或水，加盖50C水浴2min，然后15000rpm，1min。离心后液体-20C保存。
10. 测序
突变后氨基酸序列没有变化仍可用于表达。测序报告中blast时若有‘－’符号，则人工对照测序图谱。
测序验证后没有突变或者同义突变的重组质粒必须小抽，50ul，conc300ug/ml备份。测序文件应妥善保存，蛋白表达完成后一并提交存档。
获得GS后，即可构建含GE的重组T载体，用于表达。GE T载体的构建与GS T载体构建步骤相同(GS的引物需加酶切位点和保护碱基)
若序列正确，应及时保存相应的质粒及细菌(DH5α)。保存要求：小抽质粒50ul，细菌0.6~1.0ml于30％甘油中。
菌种保存及复苏
保存：
在0.6ml过夜培养物中加入0.2ml灭菌的60%甘油。Vortex以确保甘油分散均匀。置于-70C保存
复苏：
用灭菌的接种环刮拭冻结的培养物表面，立即将黏附在接种环上的细菌划在含有适当抗生素的LB平板表面。将冻结的培养物放回-70C冻存，平板于37C培养过夜.
表达质粒构建
表达质粒构建概括而言即是将GE上的目的基因插入pET28、30等表达载体上。一般插入至少2个表达载体上，提高蛋白表达的概率。
11．T载体和表达载体双酶切
System（20ul）
表达载体 12ul
双酶切buffer 2ul
限制性酶a/b 1/1ul
ddH2O 4ul
T载体双酶切10ul体系即可；表达载体切20ul体系。
37。C水浴30min～1h
有些限制性酶buffer需要加BSA，视情况而定。
双酶切后跑电泳，胶回收相应条带，进行连接反应。
12. 酶切产物的连接
System（10ul）
10×连接缓冲液 1μl
PCR目的片断双酶切产物 5μl
空质粒双酶切产物 2μl
T4 DNA连接酶 0.5μl
ddH2O 1.5μl
16C连接3h以上，一般3h后即可用于转化。也可置于4C连接过夜。
如T载体双酶切的目的基因条带比较淡，可以增加体积至6.5ul连接。连接时表达载体的量应该少于T载体双酶切产物的量，使之充分连接。
13．连接产物转化DH5α（预开42C水浴）
与T载体转化相同，先转化DH5α，筛选及扩增目的重组质粒
转化DH5α后挑6～8个菌落验证，验证项目：
1． 目的基因引物PCR验证
2． 表达载体引物PCR验证
3． Step2中PCR产物胶回收后，以胶回收为模板、基因引物进行nest PCR
4． 小抽双酶切验证
验证后再小量抽提质粒，保存50ul质粒及相应的DH5α细菌
小抽重组质粒转化表达菌BL21。转化BL21后只需基因引物PCR验证
目的基因表达
14．快速诱导表达
快速诱导目的是为检测该重组质粒在BL21中是否能被诱导表达重组蛋白，并确定在不同IPTG浓度蛋白诱导效率的差异。
5． 挑单克隆菌落于7ml含有相应抗生素LB培养液的50ml培养管中，37C振荡培养过夜（8-16h）。
6． 37C，1mM
IPTG终浓度诱导蛋白。取700ul过夜摇菌加入7ml含有相应抗生素LB培养液的50ml离心管中，于OD600＝0.4-0.6（1:100接种，37C培养时，细菌生长至OD600＝0.4-0.6约需2h）时加入终浓度为1mM的IPTG。
7． 诱导前在37C培养的菌液中取1ml未诱导的对照，按1ml菌液×OD600×100μl的比例(如1ml OD600为0.4的菌加40ul
buffer)加入2×上样缓冲液，混匀，-20℃保存或直接上样。
8． 根据蛋白分子量大小配置相应浓度的SDS-PAGE胶。（50KD蛋白10％或12％）
9． 诱导3-4h后收集菌液，取1ml样品，测OD600，10000rpm，1min离心去上清后加入相应体积的2×上样缓冲液，vortex。
10． 将收集的菌液在水中煮5min，上样10μl ，120V电压走浓缩胶，加电压至150V进入分离胶电泳，直到染料刚好走到胶底。
11．
取下胶，考马斯亮蓝染色至少30min（染液若是新配的，染20min就够了），脱色液脱色。若急需看到结果，可以将胶在500ml蒸馏水中煮沸两次即可看到条带。
注意：
a.记录诱导后菌液的OD600
b.SDS-PAGE结果确定蛋白诱导后，再进行低温小量蛋白表达
c.制备的两个重组表达载体可同时进行快速诱导
SDS-PAGE胶样品排列：
MarkerUII 37CUI’I’
Marker：低分子量蛋白marker，上样10ul
UI：未诱导菌液，上样10ul。任取37C和20C中一个
I：诱导后对照，上样10ul
UI’, I’代表GST等空载体转化的BL21未诱导和诱导后的对照
若表达载体是GST等大分子蛋白tag，则应做一个诱导空载体的对照。SDS-PAGE时取未诱导的空载体和诱导后的空载体一起上样（诱导温度37C，IPTG
1mM），以检测诱导体系是否成功。
15. 小量蛋白诱导表达
该步骤的目的是检测蛋白是否在上清存在表达。低温时蛋白易于表达于上清，因此小量蛋白诱导表达以20或30C为培养温度。
1. 挑一单克隆的菌落于5ml含有相应的抗生素的LB培养液中，37℃振荡培养过夜（8-16h）。
2.
过夜培养液加入三瓶50ml含有相应的抗生素LB锥形瓶中（用250ml以上锥形瓶摇菌，保证培养液体积不超过菌液体积的25％，给细菌良好的生长环境），20/30℃振荡培养至OD600达到0.4-0.6。一般转种诱导的比例为1：100，或者1：50(实际条件数可根据情况调整，如IPTG梯度、延迟诱导，加无水乙醇等)
3. 取1ml培养液测其OD600值，收集细菌，按1ml菌液×OD600加入100μl的比例加入2×上样缓冲液，混匀，-20℃保存或直接上样。
4. 诱导时加入相应的IPTG浓度(0.1, 0.5,
1mM)，20/30℃振荡培养。每隔1h取1ml样品，以观察目的蛋白表达是否会在一定时间降解，诱导4h左右。若IPTG浓度较低，如0.01,0.001mM，可诱导过夜。(低IPTG浓度可降低目的蛋白合成的速度，使细菌有相对充分的时间对目的蛋白进行折叠，形成可溶蛋白)
5. 根据蛋白分子量大小配置相应浓度的SDS-PAGE胶。（50KD蛋白10％或12％）
6. 诱导大约4h后收集菌液，取40ml菌液于50ml离心管中，7000rpm，15min，4C。去上清，离心管置于冰上15min。
7. 以每100ml OD600为1.5菌液加入4ml 1×PBS的比例重悬湿菌，先用枪头打碎菌块，再vortex
1×PBS中可加入低浓度变性剂如Triton-100（0.1%-3%）, Triton-100等帮助目的蛋白融解，同时不会影响目的蛋白活性。
8. 超声破碎前加入终浓度为1mM的PMSF或其他蛋白酶抑制剂，防止目的蛋白降解。PMSF有剧毒，拿装PMSF的试管时必须带上手套。
9. 取1ml PBS重悬菌液于1.5ml
EP管中超声，超声时EP管置于冰上（超声时不定期查看，防止EP管掉入冰水中）。10s超声，15s间隔，200w，20－25次。剩余的重悬菌液4C保存，作为诱导后的对照。若制备的超声后样品需过夜，过夜前再加入一定量的PMSF。PMSF在水中不稳定，活性时间仅为数小时。
10. 4C，12000rpm，15min。上清置入新EP管中，沉淀用1ml PBS充分重悬。
11. 取10ul超声前、超声后的上清和重悬沉淀上SDS-PAGE。
12. 将收集的菌液在水中煮5min，按照相应的要求上样 ，120V电压走浓缩胶，加电压至150V进入分离胶电泳，直到染料刚好走到胶底。
13.
取下胶，考马斯亮蓝染色至少30min（染液若是新配的，染20min就够了），脱色液脱色。若急需看到结果，可以将胶在500ml蒸馏水中煮沸两次即可看到条带。
注意：
a. 20C诱导前可以使细菌先37C培养，加快细菌生长速度。但诱导前30min必须在20C培养，以使细菌适应20C的生长环境。
b. 在处理蛋白的过程中，尽量在冰上操作，避免蛋白变性或降解。
c.
在蛋白表达中，小量表达摸索条件是非常关键的，往往也是耗费时间最多的步骤，为了能在上清中获得目标蛋白，有必要对每一个表达的蛋白摸索以下条件：IPTG浓度(最好过夜)，温度，乙醇，延迟诱导(OD为1.0时诱导)等。同时在处理蛋白时，也应用1％～3％的triton-100摸索条件。
SDS-PAGE胶样品排列：
MUIBS1S1P1BS2S2P2UIT1T2T3T4
M：marker；上样10ul
UI：未诱导对照；10ul
BS：超声前样品；10ul
S：超声后上清； 10ul
P：超声后沉淀； 10ul
T：诱导后每隔1h样品，10ul
BS1，BS2表示诱导时IPTG浓度不同的两种诱导条件样品。S和P后的数字同理，Ti表示时间间隔为1h的诱导后样品。
增加目的蛋白以活性形式上清表达的方法
1．
低温诱导（15-30C）。37C诱导时大肠杆菌的代谢合成很快，使目标蛋白来不及充分折叠就形成包涵体。低温使细菌蛋白合成减慢，可能使蛋白表达在上清中。以及低温可以启动hsps的表达。该法可以与降低IPTG浓度同时使用。IPTG浓度降低可减少目的蛋白的诱导量。
2． 加入DNase/RNase，防止蛋白因与DNA/RNA结合生成IBs。
3． 超声前或超声后加入低浓度的表面活性剂，如2％Triton
X-100，Tween-20等。这些活性剂能使一部分IB形式的蛋白融解，同时不影响蛋白活性。
4．
加入1-3%乙醇(v/v)，使大肠杆菌中hsps蛋白表达。Hsps蛋白可帮助蛋白折叠。乙醇的加入可将上清蛋白表达量增加2-3倍。由于hsps蛋白的表达在加入乙醇后20-30min，因此加入乙醇应在IPTG诱导前30min。该法只能少量提高目的蛋白在上清的表达量。
5． 加入终浓度为0.4M的蔗糖。或者甜菜碱和山梨醇。《抗体工程药物》
6．
更换带有在大肠杆菌中高度表达的蛋白tag的表达载体，如GST（26KD），Nus（50KD），或使目的蛋白分泌到胞外的tag，如pelB/ompT（22aa），Dsb（26KD）等。
7． 在培养基中加1-2％的葡萄糖可以抑制lac启动子引发的本底表达，而不会影响IPTG诱导的由tac启动子控制的表达。
表达质粒构建
表达质粒构建概括而言即是将GE上的目的基因插入pET28、30等表达载体上。一般插入至少2个表达载体上，提高蛋白表达的概率。
11．T载体和表达载体双酶切
System（20ul）
表达载体 12ul
双酶切buffer 2ul
限制性酶a/b 1/1ul
ddH2O 4ul
T载体双酶切10ul体系即可；表达载体切20ul体系。
37。C水浴30min～1h
有些限制性酶buffer需要加BSA，视情况而定。
双酶切后跑电泳，胶回收相应条带，进行连接反应。
12. 酶切产物的连接
System（10ul）
10×连接缓冲液 1μl
PCR目的片断双酶切产物 5μl
空质粒双酶切产物 2μl
T4 DNA连接酶 0.5μl
ddH2O 1.5μl
16C连接3h以上，一般3h后即可用于转化。也可置于4C连接过夜。
如T载体双酶切的目的基因条带比较淡，可以增加体积至6.5ul连接。连接时表达载体的量应该少于T载体双酶切产物的量，使之充分连接。
13．连接产物转化DH5α（预开42C水浴）
与T载体转化相同，先转化DH5α，筛选及扩增目的重组质粒
转化DH5α后挑6～8个菌落验证，验证项目：
1． 目的基因引物PCR验证
2． 表达载体引物PCR验证
3． Step2中PCR产物胶回收后，以胶回收为模板、基因引物进行nest PCR
4． 小抽双酶切验证
验证后再小量抽提质粒，保存50ul质粒及相应的DH5α细菌
小抽重组质粒转化表达菌BL21。转化BL21后只需基因引物PCR验证
目的基因表达
14．快速诱导表达
快速诱导目的是为检测该重组质粒在BL21中是否能被诱导表达重组蛋白，并确定在不同IPTG浓度蛋白诱导效率的差异。
5． 挑单克隆菌落于7ml含有相应抗生素LB培养液的50ml培养管中，37C振荡培养过夜（8-16h）。
6． 37C，1mM
IPTG终浓度诱导蛋白。取700ul过夜摇菌加入7ml含有相应抗生素LB培养液的50ml离心管中，于OD600＝0.4-0.6（1:100接种，37C培养时，细菌生长至OD600＝0.4-0.6约需2h）时加入终浓度为1mM的IPTG。
7． 诱导前在37C培养的菌液中取1ml未诱导的对照，按1ml菌液×OD600×100μl的比例(如1ml OD600为0.4的菌加40ul
buffer)加入2×上样缓冲液，混匀，-20℃保存或直接上样。
8． 根据蛋白分子量大小配置相应浓度的SDS-PAGE胶。（50KD蛋白10％或12％）
9． 诱导3-4h后收集菌液，取1ml样品，测OD600，10000rpm，1min离心去上清后加入相应体积的2×上样缓冲液，vortex。
10． 将收集的菌液在水中煮5min，上样10μl ，120V电压走浓缩胶，加电压至150V进入分离胶电泳，直到染料刚好走到胶底。
11．
取下胶，考马斯亮蓝染色至少30min（染液若是新配的，染20min就够了），脱色液脱色。若急需看到结果，可以将胶在500ml蒸馏水中煮沸两次即可看到条带。
注意：
a.记录诱导后菌液的OD600
b.SDS-PAGE结果确定蛋白诱导后，再进行低温小量蛋白表达
c.制备的两个重组表达载体可同时进行快速诱导
SDS-PAGE胶样品排列：
MarkerUII 37CUI’I’
Marker：低分子量蛋白marker，上样10ul
UI：未诱导菌液，上样10ul。任取37C和20C中一个
I：诱导后对照，上样10ul
UI’, I’代表GST等空载体转化的BL21未诱导和诱导后的对照
若表达载体是GST等大分子蛋白tag，则应做一个诱导空载体的对照。SDS-PAGE时取未诱导的空载体和诱导后的空载体一起上样（诱导温度37C，IPTG
1mM），以检测诱导体系是否成功。
18．活性亲和层析
适用蛋白：任何表达在上清的融合蛋白
下面以GST tag为例(GST tag一般需要切除，事先应确认所表达蛋白上没有thrombin等蛋白酶位点)
Column Purification
1. Use a pipet to apply the bacterial sonicate (Procedure 11,page 15) to a
column of drained and washed Glutathione Sepharose 4B RediPack or Disposable
Column (Procedure 8, page 13).
– Note: If needed, the sonicate may be clarified by filtrationthrough a 0.45
µm filter before applying it to the column.
2. Remove the end cap and allow the sonicate to flow through the column.
– Note: The majority of the eluate can be discarded. However, a sample should
be
retained for analysis by SDS-PAGE (see Figure 7; see also Figure 8, page 19)
or CDNB
assay (Procedure 17, page 21) to measure the efficiency of binding to the
matrix.
3. Wash the matrix by the addition of 10 bed volumes* of 1X PBS. Allow the
column to drain. Repeat twice more for a total of three washes.
– Note: Fusion protein bound to the matrix may be eluted directly at this
stage using Glutathione Elution Buffer (see “Column Elution”), or the protein
may be cleaved on the matrix with PreScission Protease, thrombin or factor Xa
to liberate the protein of interest from the GST moiety. [Refer to Procedure
14, PreScission Protease Cleavage (page 17), Procedure 15, Thrombin Cleavage
(page 18), or to Procedure 16, Factor Xa Cleavage (page 19).
4. Once the column with bound protein has been washed and drained, replace the
bottom cap.
5. Elute the fusion protein by the addition of 1 ml of Glutathione Elution
Buffer per ml bed volume. Incubate the column at room temperature (22-25°C)
for 10 minutes to elute the fusion protein.
6. Remove the bottom cap and collect the eluate. This contains the fusion
protein.
7. Repeat the elution and collection steps twice more. Pool the three eluates.
– Note: Following the elution steps, a significant amount of fusion protein
may remain bound to the matrix. Volumes and times used for elution may vary
among fusion proteins. Additional elutions may be required. Eluates should be
monitored for GST fusion protein by SDS-PAGE (see Figure 7, page 16; see also
Figure 8,page 19) or by CDNB assay (Procedure 17, page 21).
– Note: The yield of fusion protein can be estimated by measuring the
absorbance at 280 nm. The GST affinity tag can be approximated by 1 A280 Å 0.5
mg/ml. (This is based on the extinction coefficient of the GST monomer using a
Bradford protein assay. Other protein determination methods may result in
different extinction coefficients.).
– Note: The yield of protein may also be determined by standard
chromogenic methods (e.g., Lowry, BCA,Bradford, etc.). If a Lowry or BCA type
method is to be used, the sample must first be dialyzed against 2000 volumes
of 1X PBS to remove glutathione, which can interfere with protein measurement.
The Bradford method can be performed in the presence of glutathione.
Thrombin Cleavage of Fusion Protein Bound to Column/Bulk Matrix
1. Prepare the thrombin reaction mixture as follows: For each ml of
Glutathione Sepharose bed volume*, mix 50(25) μl (U) of thrombin solution and
950 μl of 1X PBS. (When using Thrombin cleavage, 25ul thrombin can be used for
cleavage of 1 ml bed volume. There would be only 0.8mg difference in
concentration of the eluted protein. Thus, for the sake of thrift, 25ul
thrombin enzyme is equally enough. The price for 50U thrombin is 70RMB)
2. Replace the bottom cap on the washed column from Procedure 12, step 6 or
Procedure 13, step 3 and add the Thrombin Protease mixture. If batch format is
used, add Thrombin Protease mixture to Glutathione Sepharose pellet. Gently
shake or rotate the the suspension at room temperature for 2-16 hours. (In the
aim of reducing protein degradation, condition of 10~26h in 4C is recommended
for the complete and thorough digestion of the target protein)
3. Following incubation, remove the bottom cap and collect the eluate in a
clean tube. If batch format is used, centrifuge the suspension at 500 x g for
5 minutes to pellet the Sepharose beads and carefully transfer the eluate to a
clean tube. The eluate will contain the protein of interest while the GST
portion of the fusion protein remains bound to the Glutathione Sepharose
matrix.
19. 割胶回收
预先配制20cm×20cm的SDS-PAGE胶，并且割胶前先提前一天跑一块相同浓度的SDS-PAGE小胶，用于计算大胶上目的蛋白的比例。
适用蛋白：表达在IB中，tag为大分子蛋白，如GST等。
1． 用不同浓度梯度（1M, 2M, 4M,
8M）的urea缓冲液洗涤包涵体，除去多余的杂蛋白，割胶时能减少杂蛋白的共纯化。Urea梯度选择能保留目的蛋白于IB中的最大浓度。
2． 用step1摸好的urea条件重悬超声离心后的IB，vortex使充分溶解。
3． 12000rpm, 10min,4C，去除不溶于urea的细胞杂质。
4． 取4－5ml离心后的上清，加入SDS-PAGE loading buffer至1×。沸水浴5min（最好将其分装于1.5ml
EP管中，使水浴时充分受热）。其余-20C保存。
5． 水浴后上样，200V，3－4h至溴芬蓝染料走到SDS-PAGE胶底。
6．
取5－7cm的半透膜，沸水浴5min，之后放入蛋白电泳buffer中。电透析tube和frit也放入buffer中。浸泡5min除去半透膜，frit，tube上的微小气泡后，将frit放入tube带磨沙的开口中，深入大约0.2～0.5cm（若插入太高，会导致最终电透析后的蛋白浓度较低，不满足打抗体的1mg/ml浓度）。之后小心的将半透膜套在放了frit的tube开口上，用橡皮筋将半透膜套紧。尽量杜绝frit和半透膜之间的气泡，它会影响透析的效率。
7．
电泳结束后，按比例从胶上割下相应约1cm条带（当按比例的条带割下后可相应的向两边再割一点，但是电透析时中间和两边的胶必须分开透析），用镊子或尺子将胶碾碎成2mm见方的小块。
8． 将碎块小心加入电透析tube中，200V，120～150min。
9． 移出放电透析tube的架子，用注射器将tube上部的buffer吸掉。之后小心的在下部半透膜上插入注射器针头，缓缓析出其中的蛋白溶液。
10．吸取的蛋白溶液转入1.5ml EP管中，取20ul用于SDS-PAGE纯度验证，其余的-20C保存。
割胶的比例计算：
小胶（染色后）： 大胶（未染色）：
分离胶顶部――――― 分离胶顶部―――――
A cm
目的蛋白位置―――― B cm C cm 目的蛋白位置？
溴芬蓝底部位置――― 溴芬蓝底部位置――――
简单的比例计算即可得到大胶上目的蛋白的位置。
20．纯化后蛋白SDS-PAGE验证纯度
SDS-PAGE方法如前所述，该结果必须拍照存档, 格式如下：
Lane1～5：Marker、未诱导、诱导后、上清、沉淀
Lane6～9：纯化后蛋白依次按1.5, 0.75, 0.375, 0.187mg/ml上样，10ul each lane.
当lane 8看不到杂带时，蛋白纯度才符合要求
21. 其他常用操作及知识
SDS-PAGE：
蛋白质如果能融解在SDS溶液中，则它们可以按分子质量的大小加以分离。这种方法的原理为小分子质量的SDS与蛋白质的疏水基团结合，破坏了蛋白质的层叠结构，使它以舒展态稳定地存在于溶液中，每克蛋白质约结合1.4gSDS。SDS分子以它自己地负电荷掩盖了蛋白质分子原来存在的电荷，各种蛋白质分子表现出的电荷密度相等，SDS-蛋白质复合物的长度与其分子质量成比例，电泳时，它们纯粹按照分子量的大小由凝胶的分子筛效应进行分离。
层析柱的再生
Regeneration of Ni-NTA beads(from QIAGEN):
Handling
Ni-NTA matrices are stable under a wide variety of conditions and need not be
refrigerated, except to inhibit growth of microorganisms for long-term
storage. After use they should be washed for 30 minutes with 0.5M NaOH. Ni-NTA
matrices should be stored in 30% ethanol to inhibit microbial growth. The
matrix can be stored for up to one week in any of the denaturing buffers.
Reuse of Ni-NTA Resin
The reuse of Ni-NTA resin depends on the nature of the sample and should only
be performed with identical recombinant proteins. Based on the experience of
Hoffmann-La Roche Ltd. (Basel, Switzerland), who have purified more than 100
different proteins on Ni-NTA resin, we recommend a maximum of 5 runs per
column.
If the Ni-NTA Agarose changes from light blue to brownish-gray, the following
regeneration procedure is recommended.
Procedure:
1. Wash the column with 2 volumes of Regeneration Buffer (6 M GuHCl, 0.2 M
acetic acid).
2. Wash the column with 5 volumes of H2O.
3. Wash the column with 3 volumes of 2% SDS.
4. Wash the column with 1 volume of 25% EtOH.
5. Wash the column with 1 volume of 50% EtOH.
6. Wash the column with 1 volume of 75% EtOH.
7. Wash the column with 5 volumes of 100% EtOH.
8. Wash the column with 1 volume of 75% EtOH.
9. Wash the column with 1 volume of 50% EtOH.
10. Wash the column with 1 volume of 25% EtOH.
11. Wash the column with 1 volume of H2O.
12. Wash the column with 5 volumes of 100 mM EDTA, pH 8.0.
13. Wash the column with H2O.
14. Recharge the column with 2 volumes of 100 mM NiSO4.
15. Wash the column with 2 volumes of H2O.
16. Wash the column with 2 volumes of Regeneration Buffer.
17. Equilibrate with 2 volumes of a suitable buffer (e.g., Buffer A or B).
Regeneration of Glutathione Sepharose 4B(GST)
Glutathione Sepharose 4B may be regenerated for re-use by washing the gel with
2-3 bed volumes(Bed volume is equal to 0.5 x the volume of the 50% Glutathione
Sepharose slurry used or 0.75 x the volume of the originalGlutathione
Sepharose slurry) of alternating high pH (0.1 M Tris-HCl + 0.5 M NaCl, pH 8.5)
and low pH(0.1 M sodium acetate + 0.5 M NaCl, pH 4.5) buffers. This cycle
should be repeated 3 times followed by re-equilibration with 3-5 bed volumes
of 1X PBS.
If the gel appears to be losing binding capacity, it may be due to an
accumulation of precipitated, denatured or non-specifically bound proteins.
To remove precipitated or denatured substances, wash the matrix with 2 bed
volumes of 6 M guanidine hydrochloride, immediately followed by a wash with 5
bed volumes of 1X PBS.
To remove hydrophobically bound substances, wash the matrix with 3-4 bed
volumes of 70% ethanol or with 2 bed volumes of a non-ionic detergent (conc.
0.1%), immediately followed by a wash with 5 bed volumes of 1X PBS.
For long-term storage (>1 month), the following procedure of additional washes
is recommended:
1. Wash the gel twice with 10 bed volumes of 1X PBS.
2. Repeat washes using 20% ethanol.
3. Store at +4°C.
4. Re-equilibrate the gel with 1X PBS before re-use.
RbCl制备感受态细胞
需准备的灭菌器具和培养液：
SOB，Buffer 1，Buffer 2，3×200ml广口瓶，1.5ml
EP管，1×500ml离心瓶（按200ml摇菌量计算），2×50ml离心管，2×移液管（用于加Buffer 1），液氮，冰
离心管，EP管，移液管使用前均需要放在4C预冷。离心机使用前也应预冷
1．将DH5α(上批做好的感受态菌或保种的DH5a)划在LB平板上，370C培养10-12小时
2．挑单克隆于4ml SOB培养液（SOB培养液中的MgCl2 和MgSO4必须摇菌之前加，细菌活化也可以用LB培养液），370C培养过夜
3．取2ml过夜菌到200ml SOB培养液（1000ml三角椎瓶），370C培养至OD600＝0.35（约1.5小时，OD最好不能超过0.4
4．将菌迅速置于盐冰浴上15分钟（盐使冰浴更冷，也可以不用盐冰浴），同时预冷500ml离心瓶和离心机
5．将菌分装于500ml离心瓶中，5000rpm，40C离心5分钟，弃上清
6．加入64ml Buffer1，小心的吹打细菌使之混匀（最好从瓶壁上离菌落3－4cm处吹下buffer
1，不要直接吹打菌落，冰上操作。加buffer1时先预加30ml，当菌落吹打均匀后再补加34ml
buffer），冰上15min。4800rpm，40C离心5分钟，弃上清
7．将菌平均分装于两个50ml离心管中，分别加入8ml
Buffer2，悬浮细胞，悬浮方法同step6，置冰上。立即分装为100ul/每管（1.5ml离心管需预冷，无菌操作）
8．分装好的感受态菌立即放入液氮中，-700C保存
SOB 200ml
Tryptone 4g
Yeast extract 1g
NaCl 0.12g
KCl 0.1g
Autoclave
用前加入 1M MgCl2 到 10mM
1M MgSO4到 10mM (MgCl2，MgSO4混合液过滤除菌)
Buffer1 64ml
RbCl 0.768g
MnCl2*4H2O 0.636g
CaCl2*2H2O 0.096g
Glycerol 9.6g
KAC 1.92ml of 1M stock PH7.5
0.2M Hac 调PH至5.8
0.22um过滤器灭菌,40C保存
Buffer 2 20ml
MOPS 0.4ml of 0.5M stock PH6.8 MOPS不能高压灭菌
RbCl 0.024g
CaCl2*2H2O 0.22g
Glycerol 3g
0.22um过滤器灭菌,40C保存
22．常用试剂配方：
LB液体培养基
Tryptone 1g
Yeast Extract 0.5g
NaCl 1g
加蒸馏水至总体积为100ml，高压蒸汽灭菌。
LB固体培养基
Tryptone 1g
Yeast Extract 0.5g
NaCl 1g
Agar 1.5g
加蒸馏水至总体积为100ml，高压蒸汽灭菌。灭菌后培养基不烫手时加入抗生素
2×YT培养基
Tryptone 1.6g
Yeast Extract 1g
NaCl 0.5g
加蒸馏水至总体积为100ml，高压蒸汽灭菌
10×SDS-PAGE电泳缓冲液
Tris碱 60.4g
Glycine 376g
SDS 20g
先加1.3L水，溶解后蒸馏水定容至2L
蛋白脱色液
冰醋酸100ml, 甲醇100ml, H2O至1L
1×PBS缓冲液
NaCl 4g
KCl 0.1g
Na2HPO4 · 12H2O 1.79g
KH2PO4 0.12g
先溶于400ml蒸馏水中，调PH值7.3，加水定容至500ml，高压灭菌
10×PBS配置直接将相应的成分×10，配制方法相同
Tris-Cl（1M）
用800ml蒸馏水溶解121.1g Tris base，加浓盐酸调PH至所需值
应使溶液冷至室温后，方可最后调定pH值。加水定容至1L。分装后高压蒸
汽灭菌。Tris溶液的pH值因温度而定，温度每升高1C，pH值大约降低0.03单位
6×SDS sample buffer
甘油（100％） 30ml
TrisCl（pH 6.8,1.0M） 15ml
EDTA（powder） 0.22g
SDS（powder） 6g
溴酚蓝 0.03g
DTT 0.6 mol/L
Store in aliquots at -20C
也可保存于室温，但是使用前加入1/20体积的巯基乙醇，使ME终浓度为715 mM
配制时用沸水浴或电磁搅拌器加热，烧杯顶部用锡纸封闭，防止水分蒸发
过滤除菌
30％丙烯酰胺
丙烯酰胺 60g
亚甲双丙稀酰胺 1.6g
加蒸馏水至200ml
TrisCl pH 8.8（1.5mol/L）
在50ml蒸馏水中溶解18.2g Tris base，用1mol/L HCl调pH至8.8，补加蒸馏水至100ml。4度保存
TrisCl pH 6.8 （1.0mol/L）
在50ml蒸馏水中溶解12.1g Tris based，用HCl调pH至6.8，定容至100ml
10％过硫酸胺（AP）
1g AP溶于10ml蒸馏水中。4C不能长期存放，一般2－3周
10％SDS
称取20gSDS慢慢转移到约含150ml的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定容至200ml
IPTG（1 M）
用8ml蒸馏水融解2.38g IPTG配制成1 M的溶液，用蒸馏水定溶至10ml。用0.22um过滤器过滤除菌，store -20C
Amp(50mg/ml)
溶解1g
Amp于足量的水中，最后定容至20ml。分装成小份于-20℃贮存。常以20～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基，1:1000比例稀释
Kan(50mg/ml)
溶解1g
Kan于足量的水中，最后定容至20ml。分装成小份于-20℃贮存。常以20～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基，1:1000比例稀释
EB
100ml蒸馏水中加1g EB，磁力搅拌数小时，以确保完全融解。然后用铝箔包裹容器或将容器转移至棕色瓶中，室温保存
TAE（50×）
Tris base 242g
冰醋酸 57.1ml
EDTA 0.05mol
调PH至8.5，定容至1L
考马斯亮蓝R-250染色液
乙醇 135ml
水 135ml
冰醋酸 30ml
考马斯亮蓝R-250粉末 0.75g
过滤除去颗粒，乙酸过滤后加入
溶菌酶（10mg/ml）
每克溶菌酶溶于100ml 10mM，PH=8.0，灭菌的TrisCl中，4C store
DTT(1M)
用20ml 0.01M乙酸钠溶液(pH5.2)溶解3.09g DTT，过滤除菌后分装成小份，储存于-20C
dNTPs
100mM初浓度，按照每种20ul量加，最后定容至800ul。终浓度为每种dNTP 2.5mM
PMSF(50mM)
溶解87mg的PMSF（苯甲基磺酰氟）于足量的异丙醇中，定容到10ml。分成小份并用铝箔将装液管包裹，-20C保存。
20% Triton-100
20ml 100％ Triton-100溶于80ml PBS或TBS中，水浴搅拌融化。使用时加至所需终浓度
5％ X-Gal
溶解50mg的X-Gal于1ml的DMF或DMSO中, 用铝箔包裹装液管，贮存于-20℃。每次配1ml，分装。否则放在-20C X-Gal最多保存4个月
Glutathione Elution Buffer
10 mM reduced glutathione in 50 mM Tris-HCl (pH 8.0). Dispense in 1-10 ml
aliquots and store at -20°C until needed. Avoid more that five freeze/thaw
cycles.
(配40ml 20mM的：0.242Tris base到40ml ddwater中，PH8.0，再加glu0.246g。)
Buffers for His purification in denatured conditions:
配制时加终体积50％的水，之后定容至所需体积。先配pH 8.0的buffer(调pH需要较多NaOH)，再统一配bufferC，D，E，分别调pH
Buffer B (200ml):
100 mM NaH2PO4 3.12 g NaH2PO4·2H2O (MW 156 g/mol)
10 mM Tris·Cl 0.24g Tris base (MW 121.1 g/mol)
8 M urea 96.1 g (MW 60.06 g/mol)
Adjust pH to 8.0 using NaOH.
Buffer C (200ml):
100 mM NaH2PO4 3.12 g NaH2PO4·2H2O (MW 156 g/mol)
10 mM Tris·Cl 0.24g Tris base (MW 121.1 g/mol)
8 M urea 96.1 g (MW 60.06 g/mol)
Adjust pH to 6.3 using HCl.
Buffer D (200ml):
100 mM NaH2PO4 3.12 g NaH2PO4·2H2O (MW 156 g/mol)
10 mM Tris·Cl 0.24g Tris base (MW 121.1 g/mol)
8 M urea 96.1 g (MW 60.06 g/mol)
Adjust pH to 5.9 using HCl.
Buffer E (200ml):
100 mM NaH2PO4 3.12 g NaH2PO4·2H2O (MW 156 g/mol)
10 mM Tris·Cl 0.24g Tris base (MW 121.1 g/mol)
8 M urea 96.1 g (MW 60.06 g/mol)
Adjust pH to 4.5 using HCl.
Note: Due to the dissociation of urea, the pH of Buffers B, C, D, and E
should be
adjusted immediately prior to use. Do not autoclave.
SDS-PAGE胶配方
SDS-PAGE分离胶配方
5ml8.5ml10ml15ml17.5ml20ml25ml30ml40ml50ml
6％胶
水2.64.425.37.99.110.613.215.921.226.5
30％聚丙烯酰胺混合液11.7233.5456810
1.5M Tris(pH=8.8)1.32.212.53.84.5556.37.51012.5
10% SDS0.050.0850.10.150.1750.20.250.30.40.5
10% AP0.050.0850.10.150.1750.20.250.30.40.5
TEMED0.0040.00680.0080.0120.0140.0160.020.0240.0320.04
8％胶
水2.33.914.66.98.059.311.513.918.523.2
30％聚丙烯酰胺混合液1.32.212.744.555.36.7810.713.3
1.5M Tris(pH=8.8)1.32.212.53.84.5556.37.51012.5
10% SDS0.050.0850.10.150.1750.20.250.30.40.5
10% AP0.050.0850.10.150.1750.20.250.30.40.5
TEMED0.0030.00510.0060.0090.01050.0120.0150.0180.0240.03
10％胶
水1.93.2345.96.657.99.911.915.919.8
30％聚丙烯酰胺混合液1.72.893.355.956.78.31013.316.7
1.5M Tris(pH=8.8)1.32.212.53.84.5556.37.51012.5
10% SDS0.050.0850.10.150.1750.20.250.30.40.5
10% AP0.050.0850.10.150.1750.20.250.30.40.5
TEMED0.0020.00340.0040.0060.0070.0080.010.0120.0160.02
12％胶
水1.62.723.34.95.66.68.29.913.216.5
30％聚丙烯酰胺混合液23.4467810121620
1.5M Tris(pH=8.8)1.32.212.53.84.5556.37.51012.5
10% SDS0.050.0850.10.150.1750.20.250.30.40.5
10% AP0.050.0850.10.150.1750.20.250.30.40.5
TEMED0.0020.00340.0040.0060.0070.0080.010.0120.0160.02
15％胶
水1.11.872.33.43.854.65.76.99.211.5
30％聚丙烯酰胺混合液2.54.2557.58.751012.5152025
1.5M Tris(pH=8.8)1.32.212.53.84.5556.37.51012.5
10% SDS0.050.0850.10.150.1750.20.250.30.40.5
10% AP0.050.0850.10.150.1750.20.250.30.40.5
TEMED0.0020.00340.0040.0060.0070.0080.010.0120.0160.02
积层胶配方
1ml2ml3ml4ml5ml6ml8ml10ml15ml
水0.681.42.12.73.44.15.56.810.2
30％聚丙烯酰胺混合液0.170.330.50.670.8311.31.72.55
1M Tris(pH=6.8)0.130.250.380.50.630.7511.251.95
10% SDS0.010.020.030.040.050.060.080.10.15
10% AP0.010.020.030.040.050.060.080.10.15
TEMED0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0080.010.015
PCR体系配方
Taq PCR
30ul system
123456789101112131415
10×buffer369121518212427303336394245
MgCl21.83.65.47.2910.812.614.416.21819.821.623.425.227
dNTP1.22.43.64.867.28.49.610.81213.214.415.616.818
primers1.22.43.64.867.28.49.610.81213.214.415.616.818
Template123456789101112131415
Taq0.30.60.91.21.51.82.12.42.733.33.63.94.24.5
ddH2O21.54364.586107.5129150.5172193.5215236.5258279.5301322.5
pfu PCR
50ul system
12345678910
10×pfu buffer5101520253035404550
dNTP2468101214161820
Template2468101214161820
primers12345678910
pfu0.511.522.533.544.55
ddH2O39.579119158198237277316356395
10×TBS
Tris 24.4g
NaCl 80g
定容至1L，调pH至7.6
1×TTBS: 10×TBS稀释后1L加1ml吐温
10×电转缓冲液
Tris 30.2g
Glycine 150g
定容至1L ，PH 8.5
Phosphate (Sodium) buffer Chart
Phosphate (Sodium) buffer Chart
Stock solution A
2 M monobasic sodium phosphate, monohydrate (276g/L) 一水磷酸二氢钠
Stock solution B
2 M dibasic sodium phosphate (284 g/L). 磷酸氢二钠
Mixing an appropriate volume (ml) of A and B as shown in the table below
and diluting to a total volume of 200 ml, a 1 M phosphate buffer of the
required pH at room temperature.
A B pH
92.0 8.0 0.8
90.0 10.0 5.9
87.7 12.3 6.0
85.5 15.0 6.1
81.5 19.5 6.2
77.5 22.5 6.3
73.5 26.5 6.4
68.5 31.5 6.5
62.5 37.5 6.6
56.5 43.5 6.7
51.0 49.0 6.8
45.0 55.0 6.9
39.0 61.0 7.0
33.0 67.0 7.1
28.0 72.0 7.2
23.0 77.0 7.3
19.0 81.0 7.4
16.0 84.0 7.5
13.0 87.0 7.6
10.5 89.5 7.7
8.5 91.5 7.8
Preparation of 0.1M potassium phosphate buffer at 25ºC
Desired pH Volume of 1M K2HPO4 (mL)Volume of 1M KH2PO4 (mL)
5.8 8.591.5
6.0 13.286.8
6.2 19.280.8
6.4 27.872.2
6.6 38.161.9
6.8 49.750.3
7.0 61.538.5
7.2 71.728.3
7.4 80.219.8
7.6 86.613.4
7.8 90.89.2
8.0 94.0 6.0
Dilute the combined 1M stock solution to 1 litre with distilled H2O
在大肠杆菌中，当外源蛋白高水平表达的时候，极易形成包涵体，为蛋白纯化等下游工作带来很大的麻烦。下面是一些可以参考的有助于提高目的蛋白可溶性表达的实验方案：
1.降低蛋白合成的速度。可以通过以下方法实现：
a.降低培养温度
b.使用弱启动子
c.使用低拷贝数的质粒表达载体
d.降低诱导物的浓度
2.改变培养基。
a.培养基中加入可以帮助蛋白折叠的因子
b.加入缓冲液保持pH稳定
c.加入1%的葡萄糖，抑制lac启动子
d.加入山梨糖醇等可以稳定蛋白天然结构的因子
e.加入乙醇， thiols and disulfides等？
3.与分子伴侣或折叠酶共表达。
常用的分子伴侣有：
GroES-GroEL
DnaK-DnaJ-GrpE
ClpB
常用的折叠酶有：
peptidyl prolyl cis/trans isomerases (PPI's)
disulfide oxidoreductase (DsbA) and disulfide isomerase (DsbC)
protein disulfide isomerase (PDI)
4.分泌表达。使目的蛋白分泌到周质空间。
周质空间的氧化性的环境有利于二硫键的形成，而胞内则是还原性的。
周质空间有折叠酶DsbA和DsbC的存在，帮助蛋白正确折叠。
周质空间很少有蛋白酶存在，不会被水解。
可以使对细胞有毒性的蛋白大量存在。
5.使用特定的菌株。
AD494, which has a mutation in thioredoxin reductase (trxB).
Origami，a double mutant in thioredoxin reductase (trxB) and glutathione
reductase (gor).
6.与可溶性partner融合表达。
7.表达目的蛋白的一个片段。> 70 kDa的蛋白在大肠杆菌中是很难表达的。
8.体外去折叠，重新折叠。
