植物成像应用文献：TuMV VPg通过与NdhM抑制叶绿体的防御作用

图1.NbNdhM抵抗TuMV侵染机制示意图

首先，作者通过对TuMV侵染后的本氏烟草进行转录组测序分析，发现NbNdhM基因的表达水平受病毒侵染的影响。并通过实验验证其过表达可以抑制TuMV的复制，而沉默会促进病毒侵染。其次，进一步证明了NbNdhM通过诱导核周叶绿体的聚集抵御TuMV侵染，并且与TuMV VPg进行相互作用。此外，研究还显示不同植物物种的NdhM与不同病毒的蛋白均存在相互作用，表明NdhM可能是病毒侵染植物的共同靶标。最后，作者发现TuMV VPg通过与NdhM的相互作用，改变NdhM的定位并增加核积累，干扰核周叶绿体的聚集，从而抑制叶绿体的防御作用。       

本文要点          

要点一：NbNdhM基因沉默/过表达实验       

TuMV侵染初期会增加NbNdhM的表达水平，但随着侵染时间的延长，表达水平下调。研究人员利用植物活体成像系统（Lumazone sophia）可视化荧光蛋白标记的芜菁花叶病毒（TuMV-GFP）侵染程度。如图2b，c所示，在3天后，观察到感染植物叶片上出现TuMV-GFP的荧光。在4天后，NbNdhM沉默植株（TRV：NbNdhM）叶片上的荧光高于对照组（TRV：00），说明沉默NbNdhM后会促进TuMV侵染。图3a-c则证明了过表达NbNdhM可以抑制TuMV的侵染。    

图2.沉默NbNdhM促进TuMV侵染

图3.过表达NbNdhM抑制TuMV侵染

要点二：NbNdhM诱导核周叶绿体聚集抵御TuMV侵染    

过表达NbNdhM可以促进叶绿体围绕细胞核聚集，防御TuMV侵染。而沉默NbNdhM则会导致抑制这种聚集现象。

图4.NbNdhM诱导核周叶绿体聚集

要点三：TuMV蛋白VPg与NbNdhM的相互作用

作者通过酵母双杂交（Y2H）、荧光素酶互补成像（LCI）、免疫共沉淀（Co-IP）以及荧光互补实验（BiFC）等多种方法证明了TuMV蛋白VPg与NbNdhM的相互作用。             

图6.TuMV VPg与NbNdhM相互作用

(a)Y2H实验，表明芜菁花叶病毒（TuMV）VPg与NbNdhM存在相互作用。将pGBKT7-53 + pGADT7-T共转化到酵母Y2HGold中作为阳性对照；pGBKT7 + pGADT7-NbNdhM，pGBKT7-TuMV VPg + pGADT7-T以及pGBKT7-Lam + pGADT7-T作为阴性对照。共转化的酵母在含有X-α-gal和AbA的选择培养基SD-Ade-His-Leu-Trp中，30℃下培养4-6天。

(b)LCI实验，表明TuMV VPg与NbNdhM存在相互作用。在荧光素存在的情况下，共表达cLUC-NbNdhM和TuMV VPg-nLUC产生了生物发光信号；β-葡萄糖苷酸酶（GUS）为非相互作用蛋白，作为阴性对照。使用Lumazone Sophia 2048B植物活体成像系统检测。

(c)Co-IP实验，表明TuMV VPg与NbNdhM存在相互作用。NbNdhM-GFP和TuMV VPg-cMyc在本氏烟草叶片中共表达。以空GFP、TuMV VPg-cMyc、NbNdhM-GFP和GUSp-cMyc的共表达作为阴性对照。

(d)BiFC实验，表明TuMV VPg与NbNdhM存在相互作用。NbNdhM的C端与YFP的N端片段融合，TuMV VPg与YFP的C端片段融合。 

原文信息：Turnip mosaic virus impairs perinuclear chloroplast clustering to facilitate viral infection
作者：Jianping Chen，Fei Yan et al.
单位：Institute of Plant Virology，China
期刊：Plant, Cell & Environment
原文链接：https://doi.org/10.1111/pce.14157

技术应用 

荧光素酶互补成像实验（LCI技术）：将荧光素酶蛋白分为N端和C端2个功能片段, 即NLuc和CLuc。待测的2个目的蛋白分别与N-Luc和C-Luc融合。当2个目标蛋白相互作用时，NLuc和C-Luc紧密结合，恢复荧光素酶的催化活性，促使荧光素酶底物氧化而发光。通过植物活体成像系统检测生物发光的强度，从而对蛋白之间的相互作用进行定性和定量分析。此方法已被广泛应用于动植物相关领域的蛋白质互作研究。

植物活体成像系统(Lumazone)应用：高通量突变体筛选、逆境处理研究、生物节律、激素信号、蛋白互作等实验，以及甲基化和钙信号传导等极弱信号生物发光/荧光成像实验。