食管鳞状细胞癌中相关成纤维细胞促进癌细胞侵袭和巨噬细胞迁移

在全球范围内，食道癌是第七大常见癌症。食管癌由两种主要的组织学类型组成，包括食管鳞状细胞癌（ESCC）和食管腺癌（EAC）。ESCC发生的重要危险因素包括饮酒、吸烟、高淀粉饮食等，但具体机制尚不清楚。
 

肿瘤微环境（TME）可以促进肿瘤进展。TME包括各种基质细胞，例如癌症相关成纤维细胞（CAFs），肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、其他非恶性细胞，和细胞外成分（细胞因子、生长因子、细胞外基质等）。CAFs通过介导肿瘤增殖、迁移和侵袭的激活，以及诱导血管生成、刺激转移等在肿瘤进展中起关键作用。CAFs可能来源于骨髓源性间充质干细胞（MSCs）、常驻成纤维细胞、内皮细胞、脂肪细胞和上皮细胞。α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）和成纤维细胞活化蛋白（FAP）是CAFs的代表性细胞标志物，其表达升高与几种癌症的预后较差有关。研究表明，CAFs通过与TME的其他基质成分（如TAMs）相互作用间接促进肿瘤进展。
 

在日本神户大学医学研究科团队先前的一项研究中，表征了ESCC中CAFs的肿瘤促进能力和免疫抑制表型的机制。此外，在MSCs和ESCC细胞之间进行共培养测定，发现共培养的MSCs中FAP表达增加。这些FAP阳性MSCs，实验将其定义为CAF样细胞，通过分泌C-C基序趋化因子配体2（CCL2）和白细胞介素-6（IL-6）来促进ESCC细胞和巨噬细胞的迁移能力，并诱导巨噬细胞的M2极化。然而，CAFs、M2极化巨噬细胞（所谓的TAMs）和ESCC细胞之间的相互作用尚未详细阐明。

 

为了探索CAFs增强ESCC进展的机制，该团队在体外通过将MSCs与ESCC细胞共培养来建立CAF样细胞，通过cDNA微阵列分析比较了单培养MSCs和CAF样细胞之间的基因表达谱，并表征了CAF样细胞对ESCC细胞和巨噬细胞的影响。此外，确定了ESCC微环境中CAF样细胞促进肿瘤作用的可能关键参与者，这些细胞可能被用作ESCC治疗的潜在靶点。

 

MSCs 和CAF样细胞对PAI-1的表达
 

通过间接共培养法评估CAFs在ESCC微环境中的功能（图1 a）。在与三种TE-系列ESCC细胞：TE-8、TE-9、TE15细胞共培养的MSCs中诱导FAP的mRNA和蛋白表达水平。接下来将与TE-8、TE-9和TE-15细胞共培养的MSCs分别定义为CAF样细胞：CAF8、CAF9和CAF15细胞（图1 a）。通过比较单培养MSCs和CAF样细胞的基因表达谱，在CAF9中确定了110个上调的基因和128个下调的基因。热图显示了CAF9中上调基因中高表达的前50个基因（图1 b）。不同细胞组中CAF9和CAF15的基因表达模式最为相似。单培养的MSCs具有与CAF样细胞不同的表达模式。

 

在这项研究中，重点研究了丝氨酸蛋白酶抑制剂E1（SERPINE1），这是CAF样细胞中上调且高表达的基因之一（图1 b）。通过qRT-PCR证实了SERPINE1 mRNA以及IL6、CCL2和CXCL12 mRNA在CAF样细胞中的高表达水平（图1 c）。CAF样细胞分泌的PAI-1（纤溶酶原激活物抑制剂-1，由SERPINE1编码）的浓度明显高于单培养的MSCs（图1 d）。ELISA的结果验证了ESCC细胞，特别是TE-8和TE-9细胞中PAI-1的分泌（图1 d）。

 

图1   PAI-1在CAF样细胞中被诱导表达和分泌

 

针对PAI-1的中和抗体抑制CAF样细胞诱导的ESCC细胞迁移

 

与CAF样细胞CAF8、CAF9和CAF15细胞共培养，分别显著诱导了3种TE-系列ESCC细胞TE-8、TE-9和TE-15细胞的迁移和侵袭能力（图2 a、b）。添加针对PAI-1的中和抗体显著抑制了与CAF样细胞共培养的ESCC细胞的迁移和侵袭能力（图2 c、d）。

 

图2   CAF样细胞分泌的PAI-1促进ESCC细胞的迁移和侵袭

 

PAI-1通过激活Akt和Erk1/2信号通路诱导ESCC细胞的迁移和侵袭

 

使用RT-PCR和蛋白质印迹法确认了PAI-1受体LRP1在三个TE-系列ESCC细胞中的表达（图3 a、b）。为了研究PAI-1对ESCC细胞表型和信号通路的影响，将rhPAI-1应用于TE-8、TE-9和TE-15细胞。rhPAI-1显著促进了ESCC细胞的迁移和侵袭能力（图3 c、d）。此外，rhPAI-1促进TE-8和TE-9细胞的迁移。rhPAI-1在处理10或30分钟后增加p-Akt（Ser473 / Thr308）和p-Erk1/2水平（图3 e）。PI3K抑制剂LY294002和MEK1/2抑制剂PD98059抑制了rhPAI-1处理的ESCC细胞中迁移和侵袭的诱导（图3 f、g）。

 

图3   PAI-1通过激活Akt和Erk1/2信号通路促进 ESCC 细胞的迁移和侵袭

PAI-1促进ESCC细胞的迁移和侵袭，并通过LRP1激活信号通路

 

为了阐明PAI-1是否通过LRP1影响ESCC细胞的表型和信号传导，实验通过RNA干扰抑制了三个TE-系列ESCC细胞中的LRP1 mRNA。结果表明，敲低ESCC细胞中LRP1显著抑制了rhPAI-1诱导的迁移和侵袭。在ESCC细胞中LRP1敲低后，p-Akt和p-Erk1/2水平降低。

 

PAI-1通过LRP1激活Akt和Erk1/2信号通路诱导巨噬细胞的迁移和侵袭

 

实验通过与上述相同的方法证实了PAI-1对巨噬细胞的影响。与CAF样细胞共培养显著诱导巨噬细胞的迁移和侵袭。针对PAI-1的中和抗体显著抑制了CAF样细胞诱导的巨噬细胞迁移和侵袭。使用RT-PCR和蛋白质印迹证实了LRP1在巨噬细胞中的表达。研究发现rhPAI-1显著促进了巨噬细胞的迁移和侵袭能力，观察到rhPAI-1在处理10分钟后增加了巨噬细胞中的p-Akt和p-Erk1/2水平。然而，rhPAI-1不影响巨噬细胞的M2极化。LY294002和PD98059抑制了rhPAI-1诱导的巨噬细胞迁移和侵袭能力。接下来，通过RNA干扰抑制巨噬细胞中的LRP1 mRNA，发现巨噬细胞中LRP1的敲低抑制了rhPAI-1诱导的迁移和侵袭。PAI-1诱导的p-Akt和p-Erk1/2的水平也因巨噬细胞中LRP1的敲低而降低。

 

PAI-1 和 LRP1 表达水平与 ESCC 患者的临床病理因素和预后相关

 

为了明确PAI-1和LRP1的表达水平是否与ESCC患者的临床病理因素相关，实验对69例人ESCC组织中的PAI-1和LRP1进行了免疫组织化学分析。根据PAI-1在基质细胞中的免疫反应性和LRP1在癌细胞（CA）或基质细胞（ST）中的免疫反应性将ESCC组织分为高表达组和低表达组（图4 a、b、c、d），并通过双重免疫荧光确认包括CD204⁺ TAMs在内的基质细胞在人ESCC组织中表达LRP1（图4 e）。研究发现PAI-1在肿瘤基质中的高表达水平与肿瘤浸润深度、αSMA和FAP的高表达水平以及大量浸润的CD204⁺巨噬细胞密切相关。LRP1（CA）的高表达水平与FAP的高表达水平和大量浸润的CD204⁺巨噬细胞显著相关。LRP1（ST）的高表达水平与性别、肿瘤浸润深度、αSMA和FAP的高表达水平以及大量浸润的CD204⁺巨噬细胞显著相关。

 

接下来，分析了PAI-1和LRP1表达的预后值。分析显示，PAI-1和LRP1（ST）高表达水平的患者无病生存期（DFS）明显较短，LRP1（CA）高表达水平的患者肿瘤特异性生存期（CSS）明显较短。PAI-1、LRP1（CA）或LRP1（ST）表达对患者的总生存期没有显著影响。

 

接下来，根据PAI-1和LRP1（CA）免疫反应性评分的组合将患者分为三组。PAI-1和LRP1（CA）均高表达的患者与PAI-1和LRP1（CA）均低表达的患者相比，DFS和CSS显著缩短。与PAI-1和LRP1（CA）表达水平低的患者相比，PAI-1或LRP1（CA）高表达水平的患者DFS明显较短。同样，根据PAI-1和LRP1（ST）免疫反应性评分的组合将患者分为三组。PAI-1和LRP1（ST）表达水平高的患者与PAI-1和LRP1（ST）表达水平低的患者相比，DFS和CSS表达水平明显较短。此外，PAI-1和LRP1（ST）高表达水平的患者与PAI-1或LRP1（ST）低表达水平的患者相比，DFS明显较短。

 

图4   PAI-1和LRP1在人ESCC组织中的表达

 

总之，该研究证明了来源于CAFs的PAI-1通过与LRP1相互作用，通过Akt和Erk1/2的磷酸化促进了ESCC细胞和巨噬细胞的迁移和侵袭。CAFs 中的 PAI-1 是 ESCC 患者的潜在预后因素。因此，靶向PAI-1/LRP1轴可能是ESCC的一种治疗方法。
 

参考文献：Sakamoto H, Koma YI, Higashino N, Kodama T, Tanigawa K, Shimizu M, Fujikawa M, Nishio M, Shigeoka M, Kakeji Y, Yokozaki H. PAI-1 derived from cancer-associated fibroblasts in esophageal squamous cell carcinoma promotes the invasion of cancer cells and the migration of macrophages. Lab Invest. 2021 Mar;101(3):353-368. doi: 10.1038/s41374-020-00512-2. Epub 2020 Dec 12. PMID: 33311557; PMCID: PMC7892342.

 

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