二代测序NGS的常见问题及解答之基础篇（一）

随着测序技术的飞速发展，众多测序手段现已走进实验室，成为科学家的科研利器，第二代DNA测序技术又称下一代测序技术(Next-generation sequencing，NGS)是目前应用广泛的测序手段之一，下面我们通过一些普遍的问题来慢慢了解它。

Q：什么样本可以做NGS测序分析？
A:NGS实验不挑样本，动物、植物、微生物等具有遗传信息的物种都可以进行NGS测序实验分析，但是需要老师根据自己的实验设计和需求来选择测序样本类型和检测项目。

Q：我们进行分析时使用的参考基因组是怎么来的？
A:通过Denovo测序(也就是从头测序)得到数据，然后拼接得到基因组序列，再通过不断的完善和功能注释，给到我们现在使用。

Q：什么是重测序Resequencing？
A:待测物种如果有发表过的参考基因组，重新进行测序就不需要拼接，可以直接对测序reads进行短序列比对。简而言之就是对基因组序列已知的物种个体进行基因组重新测序，本质就是找变异。所以我们的重测序项目下机数据都是不拼接的。

Q：什么是测序深度，与基因覆盖度是一回事吗?
A:测序深度（Sequencing Depth）是指：测序得到的碱基总量（bp）与基因组（转录组或测序目标区域大小）的比值，是评价测序量的指标之一。例如：人类全基因组大约3G，测序深度30×的话，即获得3×30=90G的数据量；覆盖度（coverage）是指测序获得的序列占整个基因组的比例。由于基因组中的高GC、重复序列等复杂结构的存在，测序最终拼接组装获得的序列往往无法覆盖所有的区域，这部分未覆盖的区域就称为Gap。

Q：重测序要求测序深度，是越多越好吗?大约多少×合适？
A:测序深度当然是越多越好，但是考虑到芯片大小以及资源浪费的问题，一般推荐10-30×，适用于有参物种，根据分析需求不同，选择合适的深度测序(SNP/InDel >10×; SV > 20×; CNV > 30×, 转座子> 20×)，增加测序深度可以提高基因组覆盖度和变异检出率。

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