Evosep在FFPE 肿瘤活检临床生物标志物定量的灵敏度研究中的应用
标题：High-Field Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry and Parallel Reaction Monitoring Increases Sensitivity for Clinical Biomarker Quantitation from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tumor Biopsies
期刊：bioRxiv
发表日期：2022- 02-10
Abstract:
Mass spectrometry-based targeted proteomics allows objective protein quantitation of clinical biomarkers from a single section of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tumor tissue biopsies. We combined high-field asymmetric waveform ion mobility spectrometry (FAIMS) and parallel reaction monitoring (PRM) to increase assay sensitivity. The modular nature of the
FAIMS source allowed direct comparison of the performance of FAIMS-PRM to PRM. Limits of quantitation were determined by spiking synthetic peptides into a human spleen matrix. In addition, 20 clinical samples were analyzed using FAIMS-PRM and the quantitation of HER2 was compared with that obtained with the Ventana immunohistochemistry assay. FAIMS-PRM improved the overall signal-to-noise ratio over that from PRM and increased assay sensitivity in FFPE tissue analysis for four (HER2, EGFR, cMET, and KRAS) of five proteins of clinical interest. FAIMS-PRM enabled sensitive quantitation of basal HER2 expression in breast cancer samples classified as HER2 negative by immunohistochemistry. Furthermore, we determined the degree of FAIMS-dependent background reduction and showed that this correlated with an improved lower limit of quantitation with FAIMS. FAIMS-PRM is anticipated to benefit clinical trials in which multiple biomarker questions must be addressed and the availability of tumor biopsy samples is limited.
研究背景
在靶向治疗中，主要药物靶点的表达水平通常与患者对治疗的临床反应相关，因此可作为预测性生物标志物。活检样本中蛋白质生物标记物的定量分析通常用于评估临床用药的药效学效果。IHC是临床试验中药效学评估的标准方法，但IHC方法存在一定的局限性。基于质谱（MS）的选择性反应监测靶向蛋白质组学（SRM）已成为克服IHC局限性的一种有前途的蛋白质定量技术。
在使用基于SRM的HER2测量的临床试验报告中，预测曲妥珠单抗疗效的HER2表达水平的临床临界值由SRM读数确定。SRM方法具有高灵敏度，然而，在分析高复杂性临床样本时，SRM方法的灵敏度会受到影响，目前已通过使用平行反应监测（PRM）来利用高分辨率质量分析仪来解决。当分析中存在高水平的非特异性背景信号时，PRM是有利的，这在涉及福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤活检的临床分析中是常见的。迄今为止，FAIMS在PRM的Orbitrap仪器上的应用已存在，但没有对FAIMS的益处进行广泛描述。在此，作者对FAIMS-PRM方法进行了系统评估，该方法结合离子迁移率和高分辨率Orbitrap质量分析仪，以实现肿瘤临床研究中关键生物标记物的高灵敏度定量。
研究方法
1. 合成肽制剂
所有肽都是由生物化学公司合成的轻肽和重肽对。重肽用C末端R[13C615N4]或K[13C615N2]标记，同位素富集率大于99%。对于半胱氨酸，使用氨基甲基化半胱氨酸。通过HPLC进一步纯化合成肽，以达到95%以上的纯度，并通过氨基酸分析验证净肽含量。
2. 临床样品制备
来自乳腺癌患者的FFPE肿瘤活检样本，由认证医学病理学家在机构审查委员会批准下收集。每个样本制作三个组织切片，用于苏木精和伊红（H＆E）染色、HER2 IHC和激光显微切割（LMD）。
3. 图像分析和LMD
研究病理学家对H＆E染色的玻片进行激光显微切割肿瘤上皮的病理学评估，这些玻片在扫描仪上用光学扫描镜进行数字成像。HALO AI用于对载玻片进行分类和注释，以指导肿瘤上皮的LMD。
4. LC-MS分析的样品处理
从载玻片上采集的显微解剖组织样品在0.1%RapiGest中溶解，在95°C下孵育90分钟，在37°C下与氯乙酰胺烷基化，然后进行过夜胰蛋白酶消化。
5. LC-MS数据采集
脱盐样品（1.2µg）与合成同位素标记肽（6 fmol）结合。将该混合物的六分之五装载到EvoTip上，然后使用EvoSep One nanoLC系统分离，该系统与带有FAIMS-PRO接口的Orbitrap Fusion Lumos质谱仪耦合。肽在44 min梯度上从7%到30%乙腈（柱上）以500 nL/min的流速洗脱。FAIMS-PRM实验采用高能碰撞离解（HCD）碎裂，隔离窗口为0.7质量电荷比（m/z），目标自动增益控制为1E6离子，最大注入时间为100 ms。串联ms（ms/ms）扫描是在质心模式下使用Orbitrap探测器获得的，分辨率为30K，分辨率为200 m/z。FAIMS以标准分辨率运行，没有额外的FAIMS气体。
6. 数据分析
PRM数据使用Skyline，采用高选择性提取进行分析。通过手动分析，比较内源性肽和参考肽的共溶率和片段离子比率，确定存在干扰的片段离子。任何显示干扰的片段离子都被标记，并在定量中省略。
研究结果及讨论
1. 将FAIMS集成到PRM方法中
在这项研究中，作者选择了代表HER2、EGFR、ER、cMET和KRAS的10个肽。为了确定传输最大离子通量的最佳FAIMS CV，在直接注入合成肽的情况下，扫描每个前体的CV范围。EGFR IPLENLQIIR[M+2H]2+前体的最佳透射率在–62至–58 V之间，最大强度的一半为–72至–52 V（图1A）。将每个前体确定的最佳CV值集成到最终计划的PRM方法中，10种肽的FAIMS CV范围为–28至–58 V。此外，作者还对前驱体隔离宽度和MS/MS分辨率进行了进一步优化。比较了0.4、0.7和1.6 m/z的前体分离宽度：选择0.7 m/z作为减少干扰和保持目标肽信号之间的首选平衡。比较了30K（64 MS瞬态长度）、60K（128 MS）和120K（256 MS）的MS/MS分辨率：高分辨率数据采集所需的额外扫描时间似乎无法充分减少干扰。较高分辨率的采集也会导致较低的碎片离子信号，因此首选30K分辨率。
2. FAIMS-PRM的性能检测
为了评估FAIMS整合到PRM方法中的影响，在胰蛋白酶消化、福尔马林固定的人脾脏中测定了使用和不使用FAIMS获得的PRM分析的定量限（LOQ）。在有无FAIMS的情况下，分别在两个不同的场合采集了四条LOQ曲线和192个原始文件的LOQ曲线。在11种前体中，7种在添加FAIMs后LLOQ降低了三倍。对于所有前体，不含FAIMS的PRM实验的平均LLOQ为137 amol/µg；使用FAIMS，这一含量降低到46 amol/µg。对于全套碎片离子，37个有FAIMS的LLOQ最低，30个平均，4个没有FAIMS的LLOQ最低。图1C和1D显示了掺入脾脏基质并通过FAIMS-PRM与PRM分析的46 amol IPLENLQIIR肽的MS/MS光谱。在这种低水平下，PRM-MS/MS数据显示总离子计数较高（3.9 E5），包括干扰背景离子，但FAIMS-PRM-MS/MS显示出更清晰的光谱，总离子计数较低（9.9 E4）四倍，来自IPLENLQIIR前体的碎片离子相对强度较高。
图1E和1F显示了通过PRM与FAIMS-PRM分析的46 amol IPLENLQIIR肽片段离子的提取离子色谱图（XIC）。当使用FAIMS获取PRM时，即使使用高分辨率（30K）Orbitrap检测（图1F），PRM中检测到的干扰也会被消除（图1E）。
期刊：bioRxiv
发表日期：2022- 02-10
Abstract:
Mass spectrometry-based targeted proteomics allows objective protein quantitation of clinical biomarkers from a single section of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tumor tissue biopsies. We combined high-field asymmetric waveform ion mobility spectrometry (FAIMS) and parallel reaction monitoring (PRM) to increase assay sensitivity. The modular nature of the
FAIMS source allowed direct comparison of the performance of FAIMS-PRM to PRM. Limits of quantitation were determined by spiking synthetic peptides into a human spleen matrix. In addition, 20 clinical samples were analyzed using FAIMS-PRM and the quantitation of HER2 was compared with that obtained with the Ventana immunohistochemistry assay. FAIMS-PRM improved the overall signal-to-noise ratio over that from PRM and increased assay sensitivity in FFPE tissue analysis for four (HER2, EGFR, cMET, and KRAS) of five proteins of clinical interest. FAIMS-PRM enabled sensitive quantitation of basal HER2 expression in breast cancer samples classified as HER2 negative by immunohistochemistry. Furthermore, we determined the degree of FAIMS-dependent background reduction and showed that this correlated with an improved lower limit of quantitation with FAIMS. FAIMS-PRM is anticipated to benefit clinical trials in which multiple biomarker questions must be addressed and the availability of tumor biopsy samples is limited.
研究背景
在靶向治疗中，主要药物靶点的表达水平通常与患者对治疗的临床反应相关，因此可作为预测性生物标志物。活检样本中蛋白质生物标记物的定量分析通常用于评估临床用药的药效学效果。IHC是临床试验中药效学评估的标准方法，但IHC方法存在一定的局限性。基于质谱（MS）的选择性反应监测靶向蛋白质组学（SRM）已成为克服IHC局限性的一种有前途的蛋白质定量技术。
在使用基于SRM的HER2测量的临床试验报告中，预测曲妥珠单抗疗效的HER2表达水平的临床临界值由SRM读数确定。SRM方法具有高灵敏度，然而，在分析高复杂性临床样本时，SRM方法的灵敏度会受到影响，目前已通过使用平行反应监测（PRM）来利用高分辨率质量分析仪来解决。当分析中存在高水平的非特异性背景信号时，PRM是有利的，这在涉及福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤活检的临床分析中是常见的。迄今为止，FAIMS在PRM的Orbitrap仪器上的应用已存在，但没有对FAIMS的益处进行广泛描述。在此，作者对FAIMS-PRM方法进行了系统评估，该方法结合离子迁移率和高分辨率Orbitrap质量分析仪，以实现肿瘤临床研究中关键生物标记物的高灵敏度定量。
研究方法
1. 合成肽制剂
所有肽都是由生物化学公司合成的轻肽和重肽对。重肽用C末端R[13C615N4]或K[13C615N2]标记，同位素富集率大于99%。对于半胱氨酸，使用氨基甲基化半胱氨酸。通过HPLC进一步纯化合成肽，以达到95%以上的纯度，并通过氨基酸分析验证净肽含量。
2. 临床样品制备
来自乳腺癌患者的FFPE肿瘤活检样本，由认证医学病理学家在机构审查委员会批准下收集。每个样本制作三个组织切片，用于苏木精和伊红（H＆E）染色、HER2 IHC和激光显微切割（LMD）。
3. 图像分析和LMD
研究病理学家对H＆E染色的玻片进行激光显微切割肿瘤上皮的病理学评估，这些玻片在扫描仪上用光学扫描镜进行数字成像。HALO AI用于对载玻片进行分类和注释，以指导肿瘤上皮的LMD。
4. LC-MS分析的样品处理
从载玻片上采集的显微解剖组织样品在0.1%RapiGest中溶解，在95°C下孵育90分钟，在37°C下与氯乙酰胺烷基化，然后进行过夜胰蛋白酶消化。
5. LC-MS数据采集
脱盐样品（1.2µg）与合成同位素标记肽（6 fmol）结合。将该混合物的六分之五装载到EvoTip上，然后使用EvoSep One nanoLC系统分离，该系统与带有FAIMS-PRO接口的Orbitrap Fusion Lumos质谱仪耦合。肽在44 min梯度上从7%到30%乙腈（柱上）以500 nL/min的流速洗脱。FAIMS-PRM实验采用高能碰撞离解（HCD）碎裂，隔离窗口为0.7质量电荷比（m/z），目标自动增益控制为1E6离子，最大注入时间为100 ms。串联ms（ms/ms）扫描是在质心模式下使用Orbitrap探测器获得的，分辨率为30K，分辨率为200 m/z。FAIMS以标准分辨率运行，没有额外的FAIMS气体。
6. 数据分析
PRM数据使用Skyline，采用高选择性提取进行分析。通过手动分析，比较内源性肽和参考肽的共溶率和片段离子比率，确定存在干扰的片段离子。任何显示干扰的片段离子都被标记，并在定量中省略。
研究结果及讨论
1. 将FAIMS集成到PRM方法中
在这项研究中，作者选择了代表HER2、EGFR、ER、cMET和KRAS的10个肽。为了确定传输最大离子通量的最佳FAIMS CV，在直接注入合成肽的情况下，扫描每个前体的CV范围。EGFR IPLENLQIIR[M+2H]2+前体的最佳透射率在–62至–58 V之间，最大强度的一半为–72至–52 V（图1A）。将每个前体确定的最佳CV值集成到最终计划的PRM方法中，10种肽的FAIMS CV范围为–28至–58 V。此外，作者还对前驱体隔离宽度和MS/MS分辨率进行了进一步优化。比较了0.4、0.7和1.6 m/z的前体分离宽度：选择0.7 m/z作为减少干扰和保持目标肽信号之间的首选平衡。比较了30K（64 MS瞬态长度）、60K（128 MS）和120K（256 MS）的MS/MS分辨率：高分辨率数据采集所需的额外扫描时间似乎无法充分减少干扰。较高分辨率的采集也会导致较低的碎片离子信号，因此首选30K分辨率。
2. FAIMS-PRM的性能检测
为了评估FAIMS整合到PRM方法中的影响，在胰蛋白酶消化、福尔马林固定的人脾脏中测定了使用和不使用FAIMS获得的PRM分析的定量限（LOQ）。在有无FAIMS的情况下，分别在两个不同的场合采集了四条LOQ曲线和192个原始文件的LOQ曲线。在11种前体中，7种在添加FAIMs后LLOQ降低了三倍。对于所有前体，不含FAIMS的PRM实验的平均LLOQ为137 amol/µg；使用FAIMS，这一含量降低到46 amol/µg。对于全套碎片离子，37个有FAIMS的LLOQ最低，30个平均，4个没有FAIMS的LLOQ最低。图1C和1D显示了掺入脾脏基质并通过FAIMS-PRM与PRM分析的46 amol IPLENLQIIR肽的MS/MS光谱。在这种低水平下，PRM-MS/MS数据显示总离子计数较高（3.9 E5），包括干扰背景离子，但FAIMS-PRM-MS/MS显示出更清晰的光谱，总离子计数较低（9.9 E4）四倍，来自IPLENLQIIR前体的碎片离子相对强度较高。
图1E和1F显示了通过PRM与FAIMS-PRM分析的46 amol IPLENLQIIR肽片段离子的提取离子色谱图（XIC）。当使用FAIMS获取PRM时，即使使用高分辨率（30K）Orbitrap检测（图1F），PRM中检测到的干扰也会被消除（图1E）。
图1. F AI MS 对 EGF R I PL ENL QII R [M+ 2 H]2+ 的 PRM 分析的影响
在本研究中，FAIMS降低LLOQ的肽更有可能在基质复杂度较高且非特异性背景信号水平较高的区域洗脱。当背景离子被过滤掉后，这些肽将在更大程度上受益于FAIMS。每个目标m/z窗口注入的非特定背景离子的平均数量如图2A所示。FAIMS降低了所有目标m/z窗口的背景离子（图2B）。然而，与FAIMS整合后LLOQ降低的七个肽表明，与FAIMS整合后背景离子的降低幅度显著更大。FAIMS对通过LOQ曲线注入的总离子的影响如EGFR IPLENLQIIR[M+2H]2+前体的补充图S4所示。加标重肽的贡献可忽略不计，高达137 amol。从412 amol开始，添加FAIMS重肽后，离子注入中位数增加。在没有FAIMS的情况下，由于背景增加，仅从添加3.7 fmol重肽开始，离子注入中位数显著增加。图2. 在LLOQ中具有faims依赖性改善的多肽也具有更大的背景信号降低。
3. FAIMS-PRM在临床标本中的应用
FAIMS-PRM分析在临床样本上的性能，我们将该方法应用于20例乳腺癌患者的FFPE肿瘤活检。通过基于AI的图像分析识别的肿瘤上皮细胞通过LMD收集，以精确测量肿瘤浓度。总体工作流如图3A所示。从20个肿瘤活检样本中成功定量了所有靶蛋白。图 3B 显示了两个样品中 244 和 62 amol/µg 的 EGFR 定量。即使在62 amol水平下，围绕感兴趣峰值的非特异性背景信号的低水平也是明显的。图3C中显示了两个浓度为5718和210 amol/µg的样品的HER2定量。使用两种性能最好的肽ELVSEFSR和SGGGDLTLGLEPSEEEAPR对这些样本中的HER2水平进行量化，这两种肽均显示出与FAIMS整合后的LLOQ改善。独立于这两种肽获得的HER2定量结果高度相关（R2=0.991）（图4A）。
作者将病理学家基于IHC分析得出的HER2表达评分结果与FAIMS-PRM获得的肿瘤浓度进行比较。尽管PRM读数与IHC分数有很好的相关性，但与早期出版物一致，MS定量强调了相同IHC分数范围内广泛的肿瘤浓度（图4B）。在IHC分类为1+的八个样品中，有两个样品的HER2浓度接近HER2+样品的中值浓度。这些患者可能是HER2靶向治疗的合适人选，FISH检测呈阳性。
图3. FAIMS-PRM临床蛋白质组学工作流程。
研究结论
本文介绍的FFPE组织样本的临床蛋白质组学工作流程预计将对临床试验具有很大的实用价值，在这些临床试验中，蛋白质靶点的复用可以证明需要解决的机制和药效学问题。
参考文献
Sweet, Steve MM, et al. "High-Field Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry and Parallel Reaction Monitoring Increases Sensitivity for Clinical Biomarker Quantitation from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tumor Biopsies." bioRxiv(2022).
