CNTest中药行业黄曲霉毒素免疫亲和柱使用操作说明书
CNtest黄曲霉毒素总量免疫亲和柱-中药专用
（产品编号：QHZ103-ZY）
使用对象
CNtest免疫亲和柱由中检维康完全自主开发的系列产品，广泛地应用于中药、粮食、食品、饲料、坚果、植物油、调味品和酒类等样品的检测，该方法具有操作简单、准确性高，灵敏度高等特点。
CNtest黄曲霉毒素免疫亲和柱-中药专用柱是根据《中国药典2020版-2351真菌毒素测定法》独立开发的产品，它适用于药典中黄曲霉毒素亲和柱检测方法。同时我们对部分检测方法进行了优化，为大家提供更好的解决方案。
原理
样品经提取液提取、过滤、稀释，然后通过键合有黄曲霉毒素特殊抗体的免疫亲和柱。此时，黄曲霉毒素被亲和柱中的抗体特异性的吸附，用水或缓冲液将免疫亲和柱上的杂质除去，然后用甲醇使抗体变性，从而将黄曲霉毒素从亲和柱上洗脱下来。最后，用HPLC或荧光计进行定量检测。
储存条件
该亲和柱保存在2-8 °C条件下，绝对不能冷冻，保质期为18个月。建议在室温（18-30°C）下使用。
实验溶液制备
1) 提取液，甲醇/水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水，混合均匀。
2) 提取液，乙腈/水（9+1）：取90mL乙腈加10mL水，混合均匀。
3) HPLC流动相，甲醇-乙腈-水（20+18+62，v/v）：取200mL甲醇、180mL乙腈、620mL水，混合均匀，用0.22微米的尼龙筛过滤。
4) 标准溶液的配制：取黄曲霉毒素混标（46304-U，B1和G1为1.0ug/mL,B2和G2为0.3ug/mL），甲醇为稀释液，配制标准品溶液。例如：取100uL标准品原液于10mL容量瓶中，用甲醇定容至10mL，那么，黄曲霉毒素B1和G1为10ng/mL，黄曲霉毒素B2和G2为3ng/mL.
注：配制好的标准品溶液2-8℃冷藏保存有效期为24h。
5) 淋洗缓冲液，pH 7.0 PBS溶液：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1000mL。
或 量取100mL 10X Clover淋洗缓冲液（货号：C3007）用900mL纯水稀释，混匀。
6) 0.5%的吐温/PBS：将5.0mL吐温-20加入到1L pH 7.0 PBS溶液中，混匀。
或 量取100mL 10X 0.5%的吐温-20/pH7.0 PBS（货号：C3008）用900mL纯水稀释，混匀。
液相色谱条件
色谱柱：Cloversil-C18 4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）
流动相：甲醇-乙腈-水（20+18+62，v/v）
流速：0.8mL/min
检测器：荧光检测器，激发波长360nm,发射波长450nm
进样体积：20~100uL
光化学衍生化系统：光化学衍生器（254nm）
分析步骤
1 2020版-2351真菌毒素测定法-黄曲霉毒素测定法第一法和第二法：
1.1样品提取及稀释：
准确称取试样15.0g于均质杯中，加入3g氯化钠，准确加入75.0mL甲醇-水（7+3），以均质器高速搅拌提取2min（搅拌速度大于11000r/min）。普通滤纸过滤或4000RPM离心5min，准确移取15.0mL滤液或上清液置于50mL容量瓶中，用纯水稀释至50mL, 混匀。用玻璃纤维滤纸过滤，至滤液澄清，量取20mL滤液备用；或 4000RPM离心10min，量取20ml上清液备用。
1.2样品的净化
将免疫亲和柱连接于20.0mL玻璃注射器下。准确量取20mL处理好的样品滤液或上清液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约3mL/min（1滴/秒）流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2~3mL空气通过柱体。以3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水淋洗柱子2次（必要时可以用淋洗缓冲液10mL淋洗，再用水10mL淋洗），弃去全部流出液，并使2mL~3mL空气通过柱体。准确加入1.0mL色谱级甲醇洗脱，控制2mL/min（1滴/秒）流速，收集全部洗脱液，混匀，注入HPLC检测。
2 中检维康优化方法：
1.1样品提取及稀释：
准确称取试样5.0g于50mL离心管中，加入1g氯化钠，准确加入25.0mL乙腈-水（9+1），以均质器高速搅拌提取2min（搅拌速度大于11000r/min）。普通滤纸过滤或4000RPM离心5min，准确移取3.0mL滤液或上清液置于50mL离心管中，加入27mL0.5%的吐温/PBS稀释，混匀。用玻璃纤维滤纸过滤，至滤液澄清，量取20mL滤液备用。
1.2样品的净化
将免疫亲和柱连接于20.0mL玻璃注射器下。准确量取20mL处理好的样品滤液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约3mL/min（1滴/秒）流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2~3mL空气通过柱体。以3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水淋洗柱子，弃去全部流出液，并使2mL~3mL空气通过柱体。准确加入2.0mL色谱级甲醇洗脱（注：可以用1ml甲醇洗脱，提高方法检测灵敏度），控制2mL/min（1滴/秒）流速，收集全部洗脱液，混匀，注入HPLC检测。
注意事项
1) 样品添加回收试验时，标准品添加到样品中，静置2小时后或过夜，再进行样品前处理，否则会出现回收率偏低的现象。
2) 不要随便更改操作说明书中的操作步骤，如需更改要和本公司技术部联系，确认更改是否合理。
3) 操作步骤中，样品过柱，淋洗，洗脱时，一定要控制好流速，不能太快，否则会使检测结果偏低。
4) 如果将标准品直接过柱验证回收率时，一定要确保标准上柱液中甲醇浓度不要超过25%，乙腈浓度不要超过20%，否则会影响柱子的吸附能力。
5) 试验中使用的玻璃仪器等，一定要清洗干净，尤其是用次氯酸等处理过的仪器，否则会使检测结果偏低。
需要准备的设备及试剂（中检维康提供）
（产品编号：QHZ103-ZY）
使用对象
CNtest免疫亲和柱由中检维康完全自主开发的系列产品，广泛地应用于中药、粮食、食品、饲料、坚果、植物油、调味品和酒类等样品的检测，该方法具有操作简单、准确性高，灵敏度高等特点。
CNtest黄曲霉毒素免疫亲和柱-中药专用柱是根据《中国药典2020版-2351真菌毒素测定法》独立开发的产品，它适用于药典中黄曲霉毒素亲和柱检测方法。同时我们对部分检测方法进行了优化，为大家提供更好的解决方案。
原理
样品经提取液提取、过滤、稀释，然后通过键合有黄曲霉毒素特殊抗体的免疫亲和柱。此时，黄曲霉毒素被亲和柱中的抗体特异性的吸附，用水或缓冲液将免疫亲和柱上的杂质除去，然后用甲醇使抗体变性，从而将黄曲霉毒素从亲和柱上洗脱下来。最后，用HPLC或荧光计进行定量检测。
储存条件
该亲和柱保存在2-8 °C条件下，绝对不能冷冻，保质期为18个月。建议在室温（18-30°C）下使用。
实验溶液制备
1) 提取液，甲醇/水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水，混合均匀。
2) 提取液，乙腈/水（9+1）：取90mL乙腈加10mL水，混合均匀。
3) HPLC流动相，甲醇-乙腈-水（20+18+62，v/v）：取200mL甲醇、180mL乙腈、620mL水，混合均匀，用0.22微米的尼龙筛过滤。
4) 标准溶液的配制：取黄曲霉毒素混标（46304-U，B1和G1为1.0ug/mL,B2和G2为0.3ug/mL），甲醇为稀释液，配制标准品溶液。例如：取100uL标准品原液于10mL容量瓶中，用甲醇定容至10mL，那么，黄曲霉毒素B1和G1为10ng/mL，黄曲霉毒素B2和G2为3ng/mL.
注：配制好的标准品溶液2-8℃冷藏保存有效期为24h。
5) 淋洗缓冲液，pH 7.0 PBS溶液：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1000mL。
或 量取100mL 10X Clover淋洗缓冲液（货号：C3007）用900mL纯水稀释，混匀。
6) 0.5%的吐温/PBS：将5.0mL吐温-20加入到1L pH 7.0 PBS溶液中，混匀。
或 量取100mL 10X 0.5%的吐温-20/pH7.0 PBS（货号：C3008）用900mL纯水稀释，混匀。
液相色谱条件
色谱柱：Cloversil-C18 4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）
流动相：甲醇-乙腈-水（20+18+62，v/v）
流速：0.8mL/min
检测器：荧光检测器，激发波长360nm,发射波长450nm
进样体积：20~100uL
光化学衍生化系统：光化学衍生器（254nm）
分析步骤
1 2020版-2351真菌毒素测定法-黄曲霉毒素测定法第一法和第二法：
1.1样品提取及稀释：
准确称取试样15.0g于均质杯中，加入3g氯化钠，准确加入75.0mL甲醇-水（7+3），以均质器高速搅拌提取2min（搅拌速度大于11000r/min）。普通滤纸过滤或4000RPM离心5min，准确移取15.0mL滤液或上清液置于50mL容量瓶中，用纯水稀释至50mL, 混匀。用玻璃纤维滤纸过滤，至滤液澄清，量取20mL滤液备用；或 4000RPM离心10min，量取20ml上清液备用。
1.2样品的净化
将免疫亲和柱连接于20.0mL玻璃注射器下。准确量取20mL处理好的样品滤液或上清液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约3mL/min（1滴/秒）流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2~3mL空气通过柱体。以3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水淋洗柱子2次（必要时可以用淋洗缓冲液10mL淋洗，再用水10mL淋洗），弃去全部流出液，并使2mL~3mL空气通过柱体。准确加入1.0mL色谱级甲醇洗脱，控制2mL/min（1滴/秒）流速，收集全部洗脱液，混匀，注入HPLC检测。
2 中检维康优化方法：
1.1样品提取及稀释：
准确称取试样5.0g于50mL离心管中，加入1g氯化钠，准确加入25.0mL乙腈-水（9+1），以均质器高速搅拌提取2min（搅拌速度大于11000r/min）。普通滤纸过滤或4000RPM离心5min，准确移取3.0mL滤液或上清液置于50mL离心管中，加入27mL0.5%的吐温/PBS稀释，混匀。用玻璃纤维滤纸过滤，至滤液澄清，量取20mL滤液备用。
1.2样品的净化
将免疫亲和柱连接于20.0mL玻璃注射器下。准确量取20mL处理好的样品滤液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约3mL/min（1滴/秒）流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2~3mL空气通过柱体。以3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水淋洗柱子，弃去全部流出液，并使2mL~3mL空气通过柱体。准确加入2.0mL色谱级甲醇洗脱（注：可以用1ml甲醇洗脱，提高方法检测灵敏度），控制2mL/min（1滴/秒）流速，收集全部洗脱液，混匀，注入HPLC检测。
注意事项
1) 样品添加回收试验时，标准品添加到样品中，静置2小时后或过夜，再进行样品前处理，否则会出现回收率偏低的现象。
2) 不要随便更改操作说明书中的操作步骤，如需更改要和本公司技术部联系，确认更改是否合理。
3) 操作步骤中，样品过柱，淋洗，洗脱时，一定要控制好流速，不能太快，否则会使检测结果偏低。
4) 如果将标准品直接过柱验证回收率时，一定要确保标准上柱液中甲醇浓度不要超过25%，乙腈浓度不要超过20%，否则会影响柱子的吸附能力。
5) 试验中使用的玻璃仪器等，一定要清洗干净，尤其是用次氯酸等处理过的仪器，否则会使检测结果偏低。
需要准备的设备及试剂（中检维康提供）
| C/N编号 | 物品 |
| PHRED | 美国奥拉AURA光化学衍生器 |
| UVD | 科乐福CLOVER光化学衍生器 |
| 21022 | 科乐福CLOVER六位泵流操作架（配有1台空气泵，6个10mL针筒） |
| 20202 | 高速匀质器，转速可达18,000 r/min ~22,000 r/min |
| 31955-C | 美国CLOVER微纤维滤纸（1.5um，100张/盒） |
| 31240-C | 折叠式槽纹滤纸（100张/盒），或中速定性滤纸 |
| 36010-C | 一次性塑料烧杯(25/包) |
| 34000-C | 一次性测试管(250支/包) |
| 36020-C | 塑料漏斗(10 个/包) |
| 46304-U | 黄曲霉毒素混合标准品1.0mL （B1和G1为1.0ug/mL,B2和G2为0.3ug/mL） |
| 35016 | 色谱纯级的甲醇（4升/瓶） |
| C546150-U | 科乐福Cloversil C18 反相色谱柱4.6*150mm（5um） |
| C546250-U | 科乐福Cloversil C18 反相色谱柱4.6*250mm（5um） |
| 玉米、饲料等基质含有不同水平黄曲霉毒素的质控样品 | |
| C3007-250 | 10X Clover淋洗缓冲液 |
| C3008-250 | 10X 0.5%的吐温-20/pH7.0 PBS溶液 |
