全基因组甲基化定量检测技术-ＬＵＭＡ

 
 
LUMA介绍
基因组DNA甲基化(Genomic DNA Methylation, GDM)的变化被认为是正常和病理细胞过程中的重要的事件，有助于正常发育和分化以及癌症和其他疾病。在此，我们介绍一种新的方法评估全基因组DNA甲基化，称为荧光甲基化检测(Luminometric Methylation Assay，LUMA)。该方法采用甲基敏感限制性内切酶DNA裂解法联合焦磷酸测序的聚合酶延伸分析。该方法是一种定量检测技术，重现性高，易于推广。
其优点是：无需亚硫酸盐修饰，无需引物，无需PCR过程，测序反应无需磁珠等试剂，十分钟左右即可完成测序反应，方便快捷。而且，该实验只需要200-500 ng的基因组DNA，并包含一个内控以消除起始DNA数量不同的问题。整个实验过程能够在6个小时内完成。
 
技术原理
此方法由Karimiet等人于2006年建立，采用DNA甲基敏感或不敏感的限制性内切酶进行DNA裂解，随后进行生物荧光聚合酶延伸试验，以定量限制性裂解的程度。此实验使用了对CpG甲基敏感的限制酶HpaII及其对甲基不敏感的同裂酶MspI做平行反应。EcoRI被用在所有反应中作为内参。
MspI和HpaII酶切靶序列为CCGG，其CpG位点数量占整个基因组中CpG位点的8%，可以作为评估全基因组甲基化水平的一个标志物。MspI和HpaII裂解后形成5’CG粘末端,而EcoRI生产5′AATT粘末断,然后通过聚合酶延伸逐步填充苷酸。随着dNTP的成功延伸，无机焦磷酸(PPi)被释放并通过ATP硫酸化酶和5’磷酰硫酸腺苷（APS)作用下转化为ATP。随后荧光素通过荧光素酶和ATP产生一定比例的可见光并由CCD检测。
 
实验步骤
1. 酶切：每例样本分为2份DNA，分别用HpaII+EcoRI或MspI+EcoRI双酶切，酶切约4hr。
2. 纯化：酶切产物纯化回收。
3. 焦磷酸测序（Pyrosequencing），反应过程如下：
dNTPs按四个步骤添加(步骤1:dATPαS,第二步:dGTP + dCTP,第三步:dTTP和步骤4:dGTP +dCTP)。峰值对应dATPαS(步骤1)和dTTP(步骤3)的添加，都代表EcoRI裂解，因此两者应该是等值的。因此,dTTP峰用作dATPαS峰的质控。第2步，dCTP和dGTP一起添加，对应的峰值代表HpaII或MspI裂解。在步骤4中，再次添加dCTP和dGTP作为内控完成第二步，因此其相应的峰值应该是零或接近零。
 
 
 
甲基化率（%）计算：如下图

 
甲基化率={1-[HpaII(C+G)/EcoRI(A)]/[MspI(C+G)/EcoR(A)]}×100, 上图中样本甲基化GDM=57.12%
 
 
技术应用及优化
LUMA法自Karimiet等人建立以后，已经到到广泛应用，特别是最近几年表观遗传学研究的深入，此法往往配合NGS、甲基化芯片等技术对实验样本进行不同层面的表观遗传检测。在应用过程中，该方法也在不断的被评估和改进。

• Carolina Soriano-Ta´ rraga等提出此方法受DNA抽提方法的影响，同一样品抽提方法 不同得到的甲基化率有差异。但对于同样抽提方法的样品来说还是有比较好的使用价值的。
• Sofia Lisanti等提出EcoRI内切酶具有“star activity”效应，即非特异性切割（受Buffer浓度和切割时间影响）和切割不充分（对于EcoRI酶切位点GAATTC的甲基化影响酶切活性），所以作者提出使用与EcoRI有类似酶切位点的MunI替代。
• Claudia Knothe等人使用MunI同裂酶MfeI作为内控，并且提出峰值计算新公式：即用A峰和T峰的平均值替代原公式中的EcoRI(A)。

 
参考文献：

• Mohsen Karimi, et al, LUMA (LUminometric Methylation Assay)—A high throughput  method to the analysis of genomic DNA methylation. EXPERIMENTAL CELL RESEARCH 312(2006)1989–1995

2. Carolina Soriano-Ta´rraga, et al, DNA Isolation Method Is a Source of Global DNA Methylation Variability Measured with LUMA.Experimental Analysis and a Systematic Review.PLOS ONE, April 2013,Volume 8,Issue 4,e60750

• Sofia Lisanti，et al.Comparison of Methods for Quantification of Global DNA Methylation in Human Cells and Tissues. PLoS ONE 8(11): e79044. 
• Claudia Knothe,et al.Disagreement between two common biomarkers of global DNA methylation. Clinical Epigenetics (2016) 8:60
• Karilyn E. Sant,et al.DNA Methylation Screening and Analysis.  Methods Mol Biol. 2012 ; 889: 385–406.
• Regan Vryer,et al.What’s in a name? Context-dependent significance of ‘global’ methylation measures in human health and disease.Clinical Epigenetics (2017) 9:2
• Chowdhury et al.Technical advances in global DNA methylation analysis in human cancers. Journal of Biological Engineering (2017) 11:10
• Li et al.Clinical implications of genome-wide DNA methylation studies in acute myeloid leukemia.  Journal of Hematology & Oncology (2017) 10:41
• Florence K. Crary-Dooley,et al.A comparison of existing global DNA methylation assays to low-coverage whole-genome bisulfite sequencing for epidemiological studies. EPIGENETICS 2017, VOL. 12, NO. 3, 206–214
• Nojima et al.Correlation between global methylation level of peripheral blood leukocytes and serum C reactive protein level modified by MTHFR polymorphism: a cross-sectional study. BMC Cancer (2018) 18:184

 
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