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PCR实验原理及反应要素介绍
点击次数:2329 发布日期:2017-2-21  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

聚合酶链式反应

一、发展简史

     聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点,是能将微量的DNA大幅增加。因此,无论是化石中的古生物、历史人物的残骸,还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液,只要能分离出一丁点的DNA,就能用PCR加以放大,进行比对。这也是"微量证据"的威力之所在。

    1983年美国Mullis首先提出设想,1985年由其发明了聚合酶链反应,即简易DNA扩增法,意味着PCR技术的真正诞生。

二、实验原理

    类似于DNA的体内复制。

首先待扩增DNA模板加热变性解链,随之将反应混合物冷却至某一温度,这一温度可使引物与它的靶序列发生退火,再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环。

PCR过程是由变性,退火,延伸3个步骤组成的不断重复的过程。标准的PCR过程分为三步:

1.DNA变性(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DN

2.退火(复性)(40℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。

3.3.延伸(68℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右最佳的活性)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′ 端延伸,合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍。

三、PCR反应要素:

  1. DNA模版:可以是双链、单链、提取染色体的DNA、克隆的质粒DNA,
  2. 引物:一对寡聚DNA,分别与模板两侧的3’端序列互补,可使DNA序列得到扩增
  3. DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶):催化DNA合成,
  4. 缓冲液:提供DNA合成反应所需的PH,离子强度等环境
  5. 4种单核苷酸:dNTP,提供DNA合成原料
  • 实验材料

     PCR扩增仪、PCR反应管、PCR离心管、移液器、凝胶电泳设备、冰盒、离心机

模板、PCR引物、TaqDNA聚合酶、dNTP反应缓冲液、Mg2+、ddH2O。

  • PCR反应体系
  1. 以DNA为模板的反应体系:

  模板:DNA102~105拷贝

  引物

  底物:4种dNTP

  TaqDNA聚合酶

  缓冲液

  体积:

  1. 以mRNA为模板的反应(逆转录PCR)

  模板:RNA

  引物:oligo(dT)12~18

  底物:4种dNTP

  逆转录酶

  缓冲液

  其他试剂:RNA酶抑制剂,MgCl2.DTT.

来源:枫岭国际有限公司
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