蛋白指纹图谱临床应用的指导原则

 

临床上有肿瘤家族史或症象可疑者，特别是至少出现下述症状之一者都应立即进行蛋白指纹图谱检测，以期尽早发现癌症。

☆ 原因不明的疼痛及体重减轻；

☆ 伤口长期不愈；

☆ 疣或黑痣发生明显变化；

☆ 持续性消化不良、便血、血尿；

☆ 持续性嘶哑、干咳及吞咽困难；

☆ 月经期异常大出血、月经期外或绝经后出血；

☆ 耳、鼻分泌物带血、视觉障碍、听力下降、常出现耳鸣现象；

☆ 出现肿块或可触及的硬结、硬变；

☆ 肝硬化患者；

☆ 疑有胚胎细胞肿瘤；

☆ 男性大于50岁的前列腺腺瘤患者；

☆ 疑有甲状腺髓质癌或家族中出现过这类癌症的患者。

对于蛋白指纹图谱初次检测结果阳性而未见任何异常的体检对象，建议每隔三至六周复检一次。

若复检结果呈阴性，自然排除肿瘤的可能（可能是良性疾病的一过性升高）。

若连续三次呈持续阳性，应引起高度重视，详细询问病史和进行体格检查，并结合定位蛋白指纹图谱测定及各种影像学检查，以便进行肿瘤定位。

持续阳性而一时查不出阳性体征者，应继续跟踪作定期复检。还可结合受检者肿瘤家族史和当地癌谱特点进行相关检查，并适当进行预防性阻断干预。

 

蛋白指纹图谱对于判断肿瘤治疗（化疗，放疗和手术治疗）效果具有重要意义。

蛋白指纹图谱指标术前升高而于术后下降，是一个重要的预后指标；指标不下降或下降很少预示着肿瘤切除不完全或存在多发性肿瘤。如果治疗完成后，尽管外科医生和病理学家认为治疗是R0切除或是影像检查也未发现残余的肿瘤，只要蛋白指纹图谱的指标未下降到健康对照组的参考水平范围内，就预示治疗无效 。

蛋白指纹图谱在肿瘤治疗后经过一段时期一直处于正常水平，表明肿瘤已痊愈。蛋白指纹图谱在肿瘤治疗后恢复到正常水平后又再度升高，可能预示肿瘤复发和转移。蛋白指纹图谱在肿瘤治疗后仍处于高水平或继续升高，则表明治疗效果不佳 。

治疗监测期间，对蛋白指纹图谱的首次检测与复查间隔时间的设置应根据不同蛋白指纹图谱的生物半衰期。例如,参照首次治疗前水平可估计何时复查，以了解治疗是否见效。因此，复查间隔时间不宜太短，否则将可能误解为肿瘤未完全切除；但如果复查间隔太长，临床将无法区分是肿瘤复发还是初次治疗疗效不佳。

 

蛋白指纹图谱测定是外科手术切除后重要的非侵入性的监测指标。若手术后蛋白指纹图谱正常，而肿瘤复发后有所增高，则增高的速度高度预示肿瘤的进展情况。

蛋白指纹图谱指标的升高速度经常被用于评估肿瘤发展或转移情况。临床上应基于蛋白指纹图谱指标的变化， 制定进一步详细检查的时间。如果蛋白指纹图谱的指标维持在低水平或正常范围内，没必要进行其他非侵入性或昂贵的检查，但如果蛋白指纹图谱指标升高，则有必要进行上述检查。对50%的病例来说，准确测定的蛋白指纹图谱的指标将比其他检查至少早10个月预示肿瘤的进展。

临床上对肿瘤的治疗监测可通过建立一个监测日程表来观察各种标志物的动态变化，从而为一段时间内肿瘤的转移和复发提供诊断依据。这不仅有利于治疗，也很大程度上改善了预后。由于对治疗方案的从优选择，使胚胎细胞肿瘤、卵巢癌和多发性骨髓瘤患者受益匪浅。

在治疗前蛋白指纹图谱为阴性的肿瘤患者中，有可能存在蛋白指纹图谱的抗原表达，因此推荐定时监测蛋白指纹图谱，从而观察疾病的进一步进展。

在肿瘤监测期间，标志物检测的频率取决于肿瘤的特性、所推荐的监测计划以及蛋白指纹图谱的指标或肿瘤活动的可能变化。

在恶性肿瘤的治疗和病程的监测过程中，建议检测两种或多种蛋白指纹图谱，以提高临床敏感度。

 

对治疗后的癌症患者，应用蛋白指纹图谱检测，可监控癌症的复发和转移，检测的时间可参照关于蛋白指纹图谱随访的推荐方案：

术后或放、化疗结束后第6周开始第1次复查；

3年间每3个月一次；3到5年间每半年1次；

5到7年间每年1次；

7年后可停止复查；

期间如发现升高，1月内再复检1次，二次升高确证癌症复发或转移，约比临床早3到13个月。及时追加治疗，将有效延长病人生命。

 

治疗前测定1-2次；

治疗后第1次测定应在治疗后的2~14天内；

治疗后第1年和第2年，开始时每月1次，待蛋白指纹图谱显著降低后每3月1次；

治疗后第3年到第5年，每年测定2次或每年1次；

治疗后第6年起，每年测定1次。

 

某些非肿瘤的良性疾病的某些蛋白指纹图谱指标也会出现升高，如部分急性炎症：肝炎、结核；部分自身免疫性疾病：红斑狼疮、类风湿等；

蛋白指纹图谱指标在动态观察中一些良性、一过性升高者则会随病情好转而降至正常。相反，是肿瘤者不会下降或反而升高。这实际上是个逐步集中的过程。

鉴于我国国情，建议初次发现蛋白指纹图谱检测阳性者，每六周复查一次，若连续二次即十二周（三个月）保持阳性，应进行肿瘤的定位检查。

随访办法：至少在三个月内蛋白指纹图谱指标已下降的病员，可自然排除肿瘤。

 

至今还未发现理想的、具有100％灵敏度和100％特异性的肿瘤标志。因为肿瘤标志不仅在发生癌变时产生，在正常的和良性情况下也有不同程度表达；肿瘤标志的产生还受到机体一些生物活性因子的影响；血标本的采集，储存不当也会影响肿瘤标志测定的结果。因此，在肿瘤标志检测中要注意假阳性和假阴性的问题。

若从采血到血清分离的间隔时间﹥60min， 蛋白指纹图谱指标会从血小板中释放而增高；

若皮肤接触血样本试管内壁可使蛋白指纹图谱指标升高；

若样本被唾液污染，将使蛋白指纹图谱指标升高；

溶血可引起红细胞释放，而使蛋白指纹图谱指标升高；

黄疸血样本，会引起蛋白指纹图谱的指标升高；

治疗药物，如高指标的二价或三价金属离子、嘌呤类、吲哚和胍类（硝酸异山梨酯，盐酸维拉帕米）、维生素C、顺铂（抗肿瘤药）、丝裂霉素（抗肿瘤抗生素）、雌二醇、表柔比星（抗生素类药），这些药物可引起蛋白指纹图谱水平的假性上升；

接受鼠免疫球蛋白作为免疫闪烁显像诊断或免疫治疗的患者体内会产生人抗鼠免疫球蛋白抗体（HAMA）。这些嗜异性抗免疫球蛋白抗体也可出现于接受所谓的新鲜细胞治疗的患者体内，从而使蛋白指纹图谱的水平假性升高。

年龄对蛋白指纹图谱的指标有显著影响，一项研究报道，通过检测66~99岁健康个体的蛋白指纹图谱指标，发现至少10%的个体有一种蛋白指纹图谱指标出现升高。

– 有些良性疾病，如炎症疾病会使一些肿瘤标志表达增加；

– 有一些生理变化，如妊娠时和月经；

– 在肿瘤手术治疗、化疗和放疗过程中，由于肿瘤组织受到破坏或肿瘤坏死时某种肿瘤标志物的产生增加，从而影响蛋白指纹图谱的测定，造成假阳性；

– 某些治疗药物影响；

– 标本采集或处理不当，如：溶血、黄疸等。

– 产生肿瘤标志的肿瘤细胞数目少；

– 细胞或数目表面被封闭；

– 机体体液中一些抗体与蛋白指纹图谱（肿瘤抗原）形成免疫复合物；

– 肿瘤组织本身血循环差，其所产生蛋白指纹图谱不能分泌到外周血 。

 

案例1

国际著名医学杂志《柳叶刀》：蛋白指纹图谱（SELDI）以前所未有的精确度来诊断卵巢癌

从手指取少量血液，应用目前全球最先进的蛋白指纹图谱SELDI蛋白质芯片，在30分钟之内就可以知道是否患有卵巢癌。国际著名医学杂志《柳叶刀》发表了美国FDA和国立癌症研究所(NCI)的这一研究结果。专家指出，通过相关蛋白质芯片系统技术，可以使早期卵巢癌的诊断准确率达到95%，阳性预测率达到94%。这表明，卵巢癌等恶性肿瘤细胞在形成的初期就有可能被识别出来。

据统计，约有80%的卵巢癌病人被发现时已属中晚期，目前普遍使用的诊断方法，即相关肿瘤抗原检测加上超声检查等对于卵巢癌的阳性预测值只有20%左右。

目前诊断卵巢癌最知名的生物标记--肿瘤抗原125（CAI25）具有局限性。卵巢癌往 往是在晚期和转移后才被发现。在晚期的卵巢癌中，80％的CA125水平不正常，然而，这一点在临床上应用价值有限，因为晚期的卵巢癌治疗临床疗效不好。五年存活率只有35％。医生需要的是在卵巢癌的早期当癌细胞局限于卵巢时能给予他们提示的生物标记，这时候，手术就能治愈90%的患者。然而，不幸的是，只有60％的早期卵巢癌的CA125的水平是异常的。

    与此形成对比的是，在116份血清样本的试验组中，蛋白指纹图谱发现的五种蛋白模式正确地确认了所有的18个Ⅰ期卵巢癌，预测出了样品中所有的卵巢癌病例，恶性组包括了卵染上皮癌的所有亚型。唯一遗憾的是，它所预测出的66个病例中有3个患者是非恶性的，非恶性组包括了可能的假阳性，良性机能紊乱，例如子宫肌瘤和子宫内膜异位症。总的来说，蛋白指纹图预测成功率是94％（50／53），而CA125只有35%。

 卵巢癌指纹发现的不仅仅是血清中的五种蛋白，而且显示了它们之间成比例的数量关系。蛋白指纹图谱根据分子量和电荷来分离蛋白质。蛋白指纹图谱的结果分析显示了血样本中大约有15200种血清蛋白和多肽。峰的高度显示了血清中蛋白的相应丰度。如果已知需检测的蛋白SELDI分析一个血清样本的指纹图只需30分钟。所以，对于通过血清中的蛋白模式来确定是否有卵巢癌，蛋白指纹图谱的速度和成本效率是非常理想的。

Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer

Lancet, 2002, 359(9306)：572-577．

 

案例2

美国肿瘤权威杂志《癌症研究》：蛋白指纹图谱（SELDI）可以检测出前列腺癌5年前形成的蛋白指纹

前列腺癌（Prostate cancer,PCa）是常见的男性泌尿系肿瘤之一，早期诊断与治疗是降低患者死亡率、延长生存时间最有效的方法。在PCa的发生过程中，细胞恶变前后所表达的蛋白质谱发生了变化。

利用蛋白指纹图谱对以病理确诊的45例前列腺癌和45例良性前列腺增生患者血清检测，用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清PSA，对所得差异蛋白联合PSA进行分析。结果在前列腺癌和良性前列腺增生患者血清中检测到9个差异蛋白（P〈0．01），前列腺癌患者差异蛋白7个高表达，2个低表达。联合相对分子质量3771．14和4481．59两个差异蛋白诊断前列腺癌，其敏感性为96.39％，特异性为92.63％。3771．14蛋白与血清PSA诊断前列腺癌具有很强的互补性。通过蛋白指纹图谱技术可以筛选出前列腺癌的特异性标志蛋白。多个差异蛋白联合检测可以提高前列腺癌诊断的敏感性和特异性，联合3771．14蛋白与血清PSA可以更好地早期诊断前列腺癌。

通过检测患者5年前的血清，发现3771.14蛋白在前列腺癌患者细胞恶变前就已经出现了表达。通过蛋白指纹图谱技术可以检测出前列腺癌5-10年前形成的蛋白指纹，比CT及核磁成像更能准确而且早期诊断肿瘤，并为早期治愈肿瘤提供了可能。

Serum Protein Fingerprinting Coupled with a Pattern-matching Algorithm Distinguishes Prostate Cancer from Benign Prostate Hyperplasia and Healthy Men

Cancer Resraech,2002,62:3609-3614

 

案例3

英国著名杂志《Nature》:蛋白指纹图谱（SELDI）绘制“癌症指纹(cancer signature)”

人类基因组序列草图完成后，生命科学进入了“后基因组时代”,研究的重点转向了对复杂的蛋白质功能的研究。蛋白质是基因表达的最终产物，器官组织的生理状态变化会引起血清蛋白质组的改变，因此对蛋白质和蛋白质组学进行研究可以直接获取疾病的特征性标志。

由于人血清是一个蛋白质相当丰富并不断变化的系统，单一的血清肿瘤标记物难以真正反溯到相关的细胞组织，而发现一组与特定组织癌变相关的血清蛋白质(多参数标记物)则是更有效的途径，这也就是所谓的“癌症指纹(cancer signature)”。

而高通量的蛋白指纹图谱--表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术（surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）质谱技术的出现使得绘制“癌症指纹”变成了现实。目前利用SELDI技术发现肿瘤的特殊生物学标记，对于肿瘤的早期诊断具有独特的优势和重要的意义，在多种肿瘤的临床应用中显示出非常显著的效果。

Proteomics delivers on promise of cancer biomarkers

Nature Med, 2003, 9(8)：980．

 

案例4

美国著名杂志的《Science》：蛋白指纹图谱发现艾滋病蛋白抑制剂

科学家16年前就发现，非洲有2％～3％的人感染HIV后不会发展为艾滋病，但是什么物质阻止了HIV在体内的复制一直不得而知。著名艾滋病鸡尾酒疗法创立者何大一教授借助蛋白指纹图谱SELDI技术，通过比较来自艾滋病患者、感染HIV但长期存活者和正常人的CD8 T淋巴细胞的培养上清液，发现在免疫系统维持于相对正常水平的HIV感染的长期存活者中，存在一组蛋白质(分别为防御素1、a-防御素2和防御素3)水平的特异性升高。证明用特异性抗体将防御素从培养液中去除，能有效抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)的增殖。Defensin1、2、3三种蛋白对艾滋病有抑制作用，这是常人体内没有的蛋白质。并成功研制出艾滋病蛋白抑制剂。此外，蛋白指纹图谱技术参加了2003年抗击非典的斗争，短短数月即发现了SARS 感染病人的血清蛋白指纹图谱，应用SARS病人特异的四个蛋白指纹谱峰建立了SARS早期诊断模型。该成果于2004年通过了北京市科委科学成果鉴定，并申请了中国和美国专利。该项研究的文章发表在2005年1月的《Clinical Chemistry》杂志上。

Contribution of Human _-Defensin 1,2, and 3 to the Anti–HIV-1 Activity

of CD8 Antiviral Factor

Science ，2002 ，298:995–1000

Proteomic Fingerprints for Potential Application to Early Diagnosis of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)

Clinical Chemistry,2005,51,1: 56–64

 

案例5

北京协和医院：蛋白指纹图谱早期诊断肾癌

早期肾癌（RCC）常无明显症状，且无临床实用的肿瘤标记物，常延误诊断。中国医学科学院、中国协和医科大学北京协和医院泌尿外科李汉忠主任指导下在对66名RCC患者进行了蛋白指纹图谱检测，共有7个蛋白存在明显差异，分子质量分别为3190、3931、4040、4100、4131、4295和5473（p<0.01），诊断的敏感性为88%，特异性为91%。当患者血清内蛋白3190强度高于12.487或蛋白3931强度高于3.872时，则可明确诊断出I期肾癌患者，做到早期诊断。这两个蛋白为平滑肌蛋白和碳酸酐酶-I。

血清蛋白指纹图谱在肾癌诊断中的应用

中华泌尿外科杂志，2006,27（8）：527-529

 

案例6

武汉同济医院：蛋白指纹图谱监测肾移植排斥反应

肾移植排斥反应目前主要依靠肾活检。但这种创伤性检查有一定的危险性和应用的局限性。现在，华中科技大学同济医院移植研究所周平主任用蛋白指纹图谱技术对肾移植患者进行尿液检测，可无创性、24 h不问断地监测病情变化，鉴定 急性，肾移植排斥反应，其准确率高达91％~94％。这对肾移植后免疫抑制剂用量的调整、并发症与疗效判断有重大意义，也将对其他移植(肝、心)技术的精密组织配型、疗效判断、并发症等提供重要临床参考。

 

案例7

《健康报》“蛋白指纹图谱技术”：更早发现肿瘤

蛋白指纹图谱技术是随着蛋白质组学兴起出现的一种技术，一经推出便成为医学界的热点，该技术能直接检出过去无法测定的大量低丰度蛋白，大大提高蛋白质检出率，是诊断学历史上继酶学方法、免疫方法后的第三个新平台，给目前医学诊断学带来了革命性变化。蛋白质指纹图谱适用于各种疾病特异性蛋白指纹的识别与判断，具有快速、简便、准确及特异性强等特点。据权威报道，利用蛋白指纹图诊断多种肿瘤敏感性和特异性均超过80%，大大优于目前临床常用的肿瘤标志，该技术比CT、核磁更早发现肿瘤，从而使肿瘤的早期诊断、治疗成为可能。据悉，蛋白指纹图谱已在国内15至20家著名机构联合建立了中国所有肿瘤的蛋白指纹库。

 

 

案例8

《哈尔滨日报》准确检测癌症只需一滴血

本报讯（记者 吴天飞）通过绘制检查者的蛋白质指纹图谱，即可获知其患有何种癌症。 
    据该哈医大肿瘤防治研究所杜杰介绍，CT、MR等影像学检测为癌症检测首代技术，需患者肿瘤发展到一定程度方可确诊；血清免疫蛋白质检测为第二代技术，在癌症初期可发现，但确定何种癌症仍需影像技术辅助，且准确率仅为35%。蛋白质指纹图谱检测为新一代技术，它通过仪器采集检查者的一滴血，提取其血清蛋白绘制指纹图谱，如图谱在某一区域出现峰值，则表明检查者相对应的器官癌变。该方法准确率为95%至98%。 
   

案例9

《北京晚报》蛋白质指纹图谱“破译”癌症-测定准确率90％以上

本报讯（通讯员张吉吉 记者贾晓宏）通过对蛋白质不同片断的变异情况检测，可以达到90％以上的准确率并提前3年至5年，对人体不同类型肿瘤或其他疾病进行预警。 
　　专家介绍，癌症发生是一个较长的过程，早在人体某部位发生癌变前的数年前，人体内的多种蛋白质构成就已经发生改变。但在目前的国内临床肿瘤检测中，大都只采取某一种蛋白质标记物，所以导致检测的阳性率较低。而蛋白质指纹图谱是近年来国际上兴起的一种新技术，可以针对人体多种蛋白质进行测定，绘制出专属蛋白质的“指纹”图谱，大大提高了癌症诊断的阳性率。比如10个有可能发生卵巢癌的人中，一般只有3个会被目前临床采用的方法检测出来，阳性率为30％。而通过蛋白质指纹图谱，这个准确率可达98％。蛋白质指纹图谱检测的敏感性可达90％以上，可以提前3年至5年就发现一些变异的基因，从而为患者作出及时的肿瘤预警。 
　　据解放军306医院病理科主任张建中博士介绍，当前中国人患恶性肿瘤死亡率较高的主要原因是发现不及时，而蛋白质指纹图谱可以解决这个问题。

 

案例10

《健康报》蛋白质指纹图谱可更早查出疾病

本报讯（记者张荔子）4月21日，蛋白质指纹图谱技术学术研讨会在北京召开。该技术在国际上的最新进展是，可以通过一个蛋白不同片段的变异，测出不同类型肿瘤或其他疾病，具有快速、简便、准确及特异性强等特点。蛋白质指纹图谱技术标志着一种划时代的诊断模式诞生。 
　　蛋白质指纹图谱技术是随着蛋白质组学兴起的一种新技术，用于各种疾病特异性蛋白指纹的识别和判断，可以直接检测不经处理的尿液、血液或细胞裂解液等。例如传统的卵巢癌肿瘤标志物CA－125的诊断准确率约25％，而蛋白质指纹图谱技术的准确率可达100％，较CT、MRI更早发现肿瘤，使肿瘤的早诊断、早治疗成为可能。该技术于上世纪末在美国发明并应用于临床，目前美国已用开发出的卵巢癌蛋白质指纹图谱开展对卵巢癌的筛查。 
　　

 

案例11

《健康报》蛋白指纹图谱给人类带来什么

几年前，我国“973”规划《恶性肿瘤的发生与发展基础研究》首席科学家程书钧教授说过，肿瘤治疗的关键在于早期发现和早期治疗。能在CT、MRI下观察到的占位性病变已算不上最早期，当然也不是治疗的最佳时期。他提出应该从细胞生物学角度看癌变，将肿瘤扼杀在细胞萌芽期。但又有谁能如此明察秋毫呢？近来，蛋白指纹图谱技（SELDI）展现一种快速、简便、准确、特异性强的诊断技术正向人类走来。 
　　一种划时代的诊断模式诞生蛋白指纹图谱技术有多神奇？随着人类基因组测序的完成，人类拥有了解码生命本质的钥匙。但人类基因只有3万个左右，大大少于预期数量，这与人类千变万化的个体差异及 疾病表现不相匹配。实际上，生命的万千景象是通过基因的产物蛋白质表现出来的，人类的蛋白质数量约有10万多个。因此，充分挖掘和利用蛋白质中极其丰富的信息对于理解人体的生理病理活动、检测疾病的发生发展具有重大意义。 
    上世纪末，美国科学家经过10年不懈的努力，发明了一种十分有效的疾病早期诊断方法，这就是蛋白指纹图谱技术。SELDI不同于只能针对单一指标进行分析的传统检验技术，它是通过对蛋白质动态的分析，探索疾病早期最微小的指标和征兆，绝不会使大量疾病相关信息擦肩而过。以肿瘤为例，一个肿瘤细胞长成肿瘤大约需要10～15年时间。尽管目前有巴氏涂片、隐血试验、食道拉网、计算机断层扫描、超声诊断等很多早期筛查方法，但敏感性和特异性平均不到60％。据美国权威杂志《肿瘤研究》报道，蛋白指纹图谱技术可以测出前列腺癌形成5年前的蛋白指纹。因为肿瘤标志物较敏感，当肿瘤细胞数达到数千万个时，就可从血清、尿液中检测到蛋白质、酶或癌基因等生化变化。 
　　拥有个人生命光盘不再是梦想蛋白指纹究竟是什么概念？就像每个人的指纹不同于他人一样，每种疾病的特定蛋白质表达物也不一样，称之为指纹图谱是种形象比喻。蛋白指纹图谱技术是由蛋白质芯片及分析仪器—表面加强激光解析电离飞行时间质谱两部分组成，可以将病人血清中蛋白质成分的变化记录下来，绘制成蛋白指纹质谱图，并显示样品中各种蛋白的分子量、含量等信息。将这张图谱与正常人、某种疾病病人的谱图，或基因库中的谱图进行对照，就能最终发现和捕获新的特异性相关蛋白及其特征，整个测定一般几十分钟就全部完成。 
　　科学家已经确定了各种疾病的特殊标志分子，发现一个蛋白不同片段变异是不同类型肿瘤或其他疾病的标志。因此，这一技术有望为疾病的诊断、治疗和药物开发带来突破性进展。今年，美国已经将这项技术用于卵巢癌的筛查，准确率达100％。已有89种疾病可以通过这种技术检测出来，如乳腺癌、前列腺癌、肝癌等肿瘤；心肌梗死、高血压、急性心力衰竭等心血管疾病；SARS、艾滋病、病毒性肝炎等传染病；抑郁症、早老性痴呆等神经精神病学；还有糖尿病、地中海贫血等其他疾病。人在一生中的蛋白指纹图谱处于动态的不断变化过程，通过这项技术，将来人们有可能拥有自己的生命光盘，记录下个人有生以来不同阶段的蛋白指纹图谱，从分子水平了解并观察自己的生理变化，或作为治疗前后的比对参照。