近红外光学成像辅助手术导航的研究进展
近红外光学成像辅助手术导航的研究进展
杨晓峰
近年来，由于分子影像学技术的不断发展，继放射性核素成像、正电子发射断层扫描、单光子发射计算机断层和磁共振成像之后，出现了高分辨率的体内光学成像，其中近红外荧光成像倍受关注，目前前哨淋巴结成像、评价冠状动脉搭桥术后通畅度、术中识别肿瘤、医源性胆道损伤的诊断、以及淋巴管和血管的成像等都应用了近红外荧光成像技术，逐步形成了近红外荧光成像辅助外科手术导航的新的医疗技术、新的医疗设备和新的临床学科，现就有关研究进展综述如下：
1．外科诊疗与图像技术
外科手术过程中外科医生主要依据组织的色泽、质地、形态进行肿瘤的切除，所以判断切除的范围与医生的临床经验和切缘的病理阳性率有关。进一步研究认为医生在术中能够得到实时的肿瘤解剖结构图像，将提高手术成功率、降低手术创伤、减少医疗费用、避免手术意外发生、促进病人康复。而放射性核素成像、正电子发射断层扫描、单光子发射计算机断层和磁共振成像等成像设备不可能搬到外科手术室，而且这些成像设备在操作过程中对医生和病人有一定的损害，所以需要进一步探索，手术过程实时成像、操作方便、非侵入、无损害的技术。
2.近红外光的生物学特性[1]
光穿透组织的能力与组织吸收光的强弱、光波的特性、生物组织结构及其物理化学特性均有关系。650～900nm的近红外光（Near-Infrared，NIR）被称为“组织光窗(Tissue Optical Window)”，与可见光相比具有：⑴生物组织对此波段近红外光的吸收和散射效应最小，与可见光相比近红外光可穿透更深层的组织；⑵由于生物组织对此波段近红外光的自体荧光较小，信背比（Signal-to- background ratio，SBR)相对高等优点，有可能成为未来临床医学在体实时成像的重要理论。
3.近红外光学成像的基本原理[2]
生物体内的细胞或某种大分子标记荧光染料或报告基因基因时，应用体外特定波长的光波照射，穿过组织的光线，激发这些荧光材料发射荧光，体外光学影像设备摄取这些发射出的荧光，形成光学分子影像，这种光学分子影像将真实反映体内某种基因的表达或大分子的生物学特性，并动态记录和显示分子事件及其动力学过程。然而，近红外光人眼看不到，需要特殊的光学成像系统，以近红外荧光团为造影剂，当一种波长的近红外光照射外科手术野时，手术野发射出另外一种波长的近红外光，摄取这种发射的近红外光可以精确确定近红外荧光团的位置。当近红外荧光团标记到活体细胞、组织和器官时，通过手术野中的近红外光就可以显示组织的结构和病变部位。目前吲哚青绿作为近红外荧光显影剂，采用近红外光成像已经在乳腺癌、胃癌和结肠癌的临床治疗中应用。
4.近红外光学成像系统[2]
2002年美国波士顿Beth Israel Deaconess医学中心首先介绍了第一代外科成像系统，该系统可以实时摄取彩色和近红外荧光，最大的特点是既能摄取近红外荧光，又能看到手术野的解剖结构，系统被称为荧光辅助切割和探测外科成像系统（简称FLARETM），多年来该系统主要在大动物上进行外科手术的研究，有望应用到人类外科。目前美国波士顿Frangioni实验室、日本滨松光电、法国Fluoptics公司、加拿大和荷兰等研究机构从事相关研发。
4.1近红外光学成像系统的基本结构[2]
近红外光学成像系统主要包括近红外激发光源、近红外荧光造影剂、高灵敏近红外荧光摄像机、计算机及其图像处理软件等。
4.2近红外光学成像系统的分型
Ⅰ型：FLARE™ 摄像系统
FLARE™摄像系统首先是由美国波士顿Beth Israel Deaconess医学中心和乔治亚州立大学在2002年研制成功，FLARE是 fluorescence - assisted resection and exploration的缩写，即荧光辅助切除和探测。
FLARE™设计的基本方案是在外科手术时，显示器上既能显示外科手术的解剖结构，还能显示肉眼看不到的近红外荧光，并且能够重叠在彩色图像上。FLARE™系统的基本组成：⑴400W 冷光源，其中白光40,000 lux，波长400～650nm, 其二近红外激发光源之一，技术参数是光强度4 mW/cm2， 波长 700 nm (656～678 nm), 其三近红外激发光源之二，技术参数是光强度14 mW/cm2，波长800 nm (745～779 nm)，近红外光源采用环行LED排列，线性驱动集成；⑵摄像系统包括彩色摄像CCD， 400～650 nm峰值量子率效高,；700 nm近红外摄像CCD，689～725 nm峰值量子率效高, 和800 nm近红外摄像CCD ，800～848 nm峰值量子率效高,共三种CCD同时获取、像素640×480、系统分辩力125×125 μm (x,y)到 625× 625 μm (x,y)、显示刷新15 Hz、NIR 暴光时间为100 μsec 到 8 sec，免持光学自动变焦和聚焦。
Ⅱ型：Fluobeam®手持式成像系统[3]
Fluobeam®是法国Grenoble的 Fluoptics公司研制，Fluobeam®是手持式成像系统，摄取2D体外荧光，Fluobeam®有一个花冠状LED发射近红外光，能够在白光下直接检测。Fluobeam®分为Fluobeam® 700和Fluobeam® 800 2种型号。
Ⅲ型：Artemis™手持式成像系统(www.O2view.com).
Artemis™手持式成像系统是彩色和荧光双重CCD手持式摄像系统，实现全彩实时荧光成像，具有800nm吲哚青绿和 700nm荧光探针成像2种功能，适用于腹腔镜和开放手术。成像系统分辨率是659×494像素、大约330,000 pixels、图像输出5.6 x 5.6 μm、帧频5～60 fps、读取噪音30 electrons、井位能25,000 electrons，还配置390 mm和190 mm 2种型号的腹腔镜。
Ⅳ型：The Photodynamic Eye
The Photodynamic Eye是有日本滨松光电研制，主要进行非损伤床旁定量评估组织灌注量，图像感受器是CCD，发射光源是LED 。
Ⅴ型：Novadaq探测成像系统[4]
Novadaq探测成像系统（Novadaq''s SPY Imaging System）是由加拿大 Novadaq Technologies Inc.研制，是第一个，也是目前唯一一个被FDA许可进行心脏冠状动脉搭桥术后评估通畅度的设备[5]，是整形和重建外科手术，评估游离皮瓣血运的重要工具[6,7]。还可应用于器官移植，小儿外科和泌尿外科等领域。Novadaq探测成像系统重要的功能之一是能够在手术室中灵活使用，定量评定手术中的关键步骤。
如图4：整个系统被放置在一台移动车上，由 ⑴激发光/摄像机, 摄像机是30帧频/秒的CCD；⑵显示器，远端控制中心；⑶中央处理系统；(⑷激光发生器，激光发生器的输出功率是2.0 W，摄像机和激光输出伴行，激光在心脏的照射面积是56 cm2 (7.5 cm×7.5 cm) 开发手术时镜头距心脏30 厘米。
5.近红外光学成像造影剂
在近红外光波范围内，大多数组织很少产生近红外荧光，需要使用近红外光学成像造影剂，最常用的有机NIR荧光团是聚甲炔类化合物，另一类是半导体纳米晶体或量子点。
5.1 非靶向外源性造影剂
5.1.1吲哚青绿
吲哚青绿(ICG)又称靛青绿或福氏绿，是一种水溶性三碳吲哚染料，分子量775道尔顿，分子式是C43H47N2NaO6S2，最大吸收光谱805nm，最大激发波长为835nm。ICG 注入体内后既不从消化道吸收，也不进入肝循环，而是由肝实质细胞从血浆中摄取后以整分子形式排泄至胆管，随粪排出体外。近年来，ICG造影除用于研究眼部血管尤其是脉络膜血管外，还被用于烧伤深度的检测、胃肠道血管缺损、脑动脉急性梗塞患者灌注的减少检测、恶性肿瘤的诊断、微循环定量、脑部肿瘤边缘的确定和肿瘤前哨淋巴结检测等[8]。
Motomura 等[9]证实在乳腺癌周围的软组织中注射25 mg/5 mL吲哚青绿就可以识别标记的淋巴结。Later, Kitai 等[10]证实皮内注射 25 mg，能够引导乳腺癌病人哨位淋巴结活检术。此外，微量吲哚青绿与分子靶向标记物结合也能有效显示淋巴结，降低吲哚青绿的使用量。
5.2 非靶向可激活有机荧光造影剂
研究认为肿瘤的无序生长与蛋白质水解酶活性上调有关，所以蛋白质水解酶在恶性肿瘤组织中表达增加，与肿瘤的浸润和转移有关，这种荧光探针它们往往含有两个以上的等同或不同的色素团，两个色素团通过酶特异性多肽接头彼此紧密相连。多肽接头切除时，使它们的荧光团释放出来，荧光发射于是得以恢复。酶靶点主要限于蛋白酶，包括组织蛋白酶、半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶、基质金属蛋白酶、凝血酶、HIV 和 HSV蛋白酶以及尿激酶类血纤维蛋白溶酶原激活剂。
5.3靶向有机荧光造影剂
靶向有机荧光造影剂是将荧光团与能结合某一特异分子靶点（活性探针）的配体相耦合。该造影剂能结合到并停留在靶点部位，而非结合的荧光团则在循环中被清除。这种方法对于肿瘤的成像最为有用，因为癌症使得某些表面受体超表达。
配体可以是小分子、多肽、蛋白质和抗体。比如表皮生长因子受体(EGFr)/ Her2、血管上皮生长因子受体（VEGFr）以及αvβ3整合素等。现可结合的荧光团包括Cy 5.5、Alexa Fluor 750、IRdye800CW等[11-13]。
6. 近红外光学成像引导下外科诊疗的应用
6.1前哨淋巴结定位（Sentinel Lymph Node Mapping）
浸润性膀胱癌有20～25%的病人有淋巴结转移，在进行膀胱全切术是要进行淋巴结清扫。Knapp等采用IRDye™ 800CW、HSA800、近红外荧光量子点三种近红外荧光淋巴结示踪剂，其中HSA800的激发光峰值是784 nm， 发射光峰值是802 nm；近红外荧光量子点的激发光峰值是775 nm, 发射光峰值是820nm。使用第一代近红外荧光成像系统，在家犬和猪上进行试验研究，发现注射近红外荧光淋巴结示踪剂后膀胱壁立刻明亮的荧光，10秒种为淋巴管荧光显示，30秒到3分钟前哨淋巴结显影，在注射后至少2小时注射部位和前哨淋巴结仍然荧光显影。其中25%的淋巴结全部明亮荧光显影；45%的淋巴结部分显影；30%的淋巴结边缘斑点显影。同时研究发现，膀胱内压力影响淋巴结示踪剂的移动，大于 50 cm H20和小于 10 cm H2O都没有淋巴结示踪剂的移动，膀胱内压力是影响膀胱光学效果的重要因素[14]。此外乳腺癌手术，宫颈癌等多种肿瘤手术中都可以使用。
6.2 输尿管示踪（Intraoperative Ureteral Guidance）
在输尿管损伤或某些外科手术时，输尿管寻找十分困难，Tanaka等使用0.5 mW/cm2 400～700 nm的白光，和5mW/cm2 725～775 nm的近红外光，光斑直径是15厘米的近红外成像系统。研究发现在猪模型中注射7.5 μg/kg CW800-CA能够在不可见光下看到输尿管，看到输尿管内直径小于2.5 mm的异物，逆行注射10 μM ICG能够精确定位输尿管的损伤漏尿点[15]。
6.3 术中近红外荧光胆道造影（Intraoperative Near-infrared Fluorescent Cholangiography）
Tanaka等[16]使用NIR光和静脉注射 CW800-CA能够实时显示肝外胆管, 而不影响外科手术。
6.4辅助肝叶切除
Aoki等[17]使用Photo Dynamic Eye-2成像系统，在门静脉注射ICG后1分钟就可以明确区分肝脏的分段和亚分段，并可以保持10分钟。35例肝脏恶性肿瘤的病人在行肝脏部分切除时使用的该检查手段，其中33例病人肝叶区分明显，该方法有效可靠安全。
6.5评估冠状动脉搭桥术效果
常规冠状动脉造影是诊断冠状动脉有无狭窄的金标准，但在冠状动脉搭桥术中很少使用，目前常用的方法有术中荧光成像（intraoperative fluorescence imaging，IFI）和时差血流（transit-time flowmetry，TTFM）。Balacumaraswami 等认为Novadaq探测成像系统进行冠状动脉搭桥手术效果的评估，IFI要比TTFM更加灵敏，假阳性率低[18]。
6.6 脑血管外科的应用
Woitzik等[19]使用近红外荧光手术显微镜，对32例病人在手术中进行近红外荧光血管成像，静脉注射ICG 25mg/10ml。明确诊断13例脑动脉瘤、4例脑动静脉畸形 、8例为颅内外旁路，研究认为脑血管手术过程中，常规进行ICG近红外荧光血管成像是必要的。
6.7 术中识别肿瘤（dentifying tumors intraoperatively）
术中识别肿瘤包括开放手术和内窥镜手术下的肿瘤识别、肿瘤切除边缘的确定和转移淋巴结的鉴别，但还处于临床前期研究。需要进一步完善肿瘤特异性近红外荧光探针，研究肿瘤靶向抗体和无毒副作用的近红外荧光染料，开发高灵敏的近红外摄像系统[20,21]。
总之，近红外光学成像理论和技术是近十年的科学成就，随着研究的不断深入完善，将会广泛应用于临床医学的各个领域，成为新的医疗技术、医疗设备和新的临床学科。
参考文献：
1. Keereweer S, Kerrebijn JD, van Driel PB, Xie B, Kaijzel EL, Snoeks TJ, Que I, Hutteman M, van der Vorst JR, Mieog JS, Vahrmeijer AL, van de Velde CJ, Baatenburg de Jong RJ, Löwik CW. Optical Image-guided Surgery—Where Do We Stand? Mol Imaging Biol. 2011 ;13(2):199-207.
2.De Grand AM, Frangioni JV. An operational near-infrared fluorescence imaging system prototype for large animal surgery. Technol Cancer Res Treat. 2003; 2(6): 553-62.
3．Stockdale A, Oketokoun R, Gioux S, Frangioni JV (2010) Mini- FLARE: a compact and ergonomic dual-channel near-infrared fluorescence image-guided surgery system (Abstract).
4.Vogt PR, Bauer EP, Graves K. Novadaq Spy Intraoperative Imaging System--current status.Thorac Cardiovasc Surg. 2003;51(1):49-51.
5. Taggart DP, Balacumaraswami L, Venkatapathy A. Radial artery jump graft from anterior to posterior descending coronary artery. Asian Cardiovasc Thorac Ann. 2009 ; 17(2): 143-6.
6.Kawashima T, Naraoka S, Kakizaki T. Intraoperative graft assessment using fluorescent imaging system (SPY). Kyobu Geka. 2009 Jul;62(7):519-22.
7.Pestana IA, Coan B, Erdmann D, Marcus J, Levin LS, Zenn MR. Early experience with fluorescent angiography in free-tissue transfer reconstruction. Plast Reconstr Surg. 2009 ; 123(4): 1239-44.
8. Gashev AA, Nagai T, Bridenbaugh EA. Indocyanine green and lymphatic imaging: current problems. Lymphat Res Biol. 2010;8(2):127-30.
9. Motomura K, Inaji H, Komoike Y, Kasugai T, Noguchi S, Koyama H. Sentinel node biopsy guided by indocyanin green dye in breast cancer patients. Jpn J Clin Oncol 1999;29:604–607.
10. Kitai T, Inomoto T, Miwa M, Shikayama T.Fluorescence navigation with indocyanine green for detecting sentinel lymph nodes in breast cancer. Breast Cancer 2005;12:211– 215.
11. Lee SB, Hassan M, Fisher R et al. Affibody molecules for in vivo characterization of HER2-positive tumors by near-infrared imaging.Clin Cancer Res 2008;14:3840–3849
12.Hsu AR, Hou LC, Veeravagu A, Greve JM, Vogel H, Tse V, Chen X. In vivo near-infrared fluorescence imaging of integrin alphavbeta3 in an orthotopic glioblastoma model. Mol Imaging Biol. 2006 Nov-Dec;8(6):315-23.
13.Xiao W, Yao N, Peng L, Liu R, Lam KS. Near-infrared optical imaging in glioblastoma xenograft with ligand-targeting alpha 3 integrin.Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2009 ;36(1):94-103.
14.Knapp DW, Adams LG, Degrand AM, Niles JD, Ramos-Vara JA, Weil AB, O'Donnell MA, Lucroy MD, Frangioni JV. Sentinel lymph node mapping of invasive urinary bladder cancer in animal models using invisible light. Eur Urol. 2007;52(6):1700-8..
15.Tanaka E, Ohnishi S, Laurence RG, Choi HS, Humblet V, Frangioni JV. Real-time intraoperative ureteral guidance using invisible near-infrared fluorescence. J Urol. 2007 ; 178(5): 2197-202.
16.Tanaka E, Choi HS, Humblet V, Ohnishi S, Laurence RG, Frangioni JV. Real-time intraoperative assessment of the extrahepatic bile ducts in rats and pigs using invisible near-infrared fluorescent light. Surgery. 2008;144(1):39-48.
17.Aoki T, Yasuda D, Shimizu Y, Odaira M, Niiya T, Kusano T, Mitamura K, Hayashi K, Murai N, Koizumi T, Kato H, Enami Y, Miwa M, Kusano M. Image-guided liver mapping using fluorescence navigation system with indocyanine green for anatomical hepatic resection. World J Surg. 2008 ;32(8):1763-7.
18.Balacumaraswami L, Taggart DP. Intraoperative imaging techniques to assess coronary artery bypass graft patency. Ann Thorac Surg. 2007;83(6): 2251-7.
19. Woitzik J, Horn P, Vajkoczy P, Schmiedek P. Intraoperative control of extracranial-intracranial bypass patency by near-infrared indocyanine green videoangiography. J Neurosurg. 2005 ;102(4):692-8.
20. Bernal-García LM, Cabezudo-Artero JM, Ortega-Martínez M, Fernández-Portales I, Giménez-Pando J, Ugarriza-Echebarrieta LF, Mata-Gómez J, Molina-Orozco M, Malca-Balcázar JF. Fluorescence-guided resection with 5-aminolevulinic acid of an intramedullary tumor. Neurocirugia (Astur). 2010;21(4):312-6.
21. Crane LM, Themelis G, Arts HJ, Buddingh KT, Brouwers AH, Ntziachristos V, van Dam GM, van der Zee AG. Intraoperative near-infrared fluorescence imaging for sentinel lymph node detection in vulvar cancer: first clinical results. Gynecol Oncol. 2011;120(2):291-5. .
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